細葉小檗果小檗堿抑菌性能及機理

包怡紅，張俊順，符 群，張海婷

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

細葉小檗（Berberis poiretii）為小檗科小檗屬漿果，別名針雀、三顆針等。小檗屬是小檗科中大屬之一，植物多為常綠或落葉灌木，很少為喬木。本屬約有植物500余種，主要分布于亞洲東部、中部以及拉丁美洲，少數分布于歐洲、北美洲和非洲北部。我國小檗屬植物資源豐富，有250余種，約占世界的一半，全國各地均有分布，主要分布在西南、西北地區[1]。小檗屬果實主要含有甾醇、萜類化合物、花青素、酚酸類化合物，還有生物堿、有機酸、微量元素等物質[2]。細葉小檗含有的生物堿有小檗堿、小檗胺、巴馬汀、哥倫胺和苦參堿[3-4]，其中小檗堿含量高并且具有較強的生物活性[5-6]，如消炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓、保護心血管和神經系統等[7-11]。

近年來，隨著對小檗堿活性成分及藥理作用的研究深入，細葉小檗在臨床方面獲得廣泛的應用，傳統和現代研究大多集中在小檗屬植物的根、莖以及莖皮部位，然而該屬果實在研究利用方面有著巨大開發潛力[12]，劉萍[13]、徐媛[14]、符群[15]等對細葉小檗果實中小檗堿的提取工藝與抑菌活性進行研究，但對其抑菌機理的研究很少，基于此，本實驗將對小檗堿在抑菌機理方面進行補充。

如今，食源性病菌引起的食物污染嚴重威脅著人們的健康，食品腐敗變質現象普遍存在，因此抑制食源性腐敗菌的生長以延長食品貨架期變得尤為重要，本實驗主要研究了細葉小檗果實中的小檗堿對食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌4 種供試菌的抑菌活性，并對抑菌機理進行了初步的探究，為其在天然食品防腐劑中的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

細葉小檗果實采于黑龍江省鶴崗市。

供試菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由東北林業大學微生物實驗室提供。

Y 3 1 J 9 H 6 7 0 2 4 小檗堿標準品（純度＞9 8%）上海源葉生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、MH（B）培養基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、戊二醛、叔丁醇、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、四甲基乙二胺、巰基乙醇、溴酚藍、甘油、甘氨酸（均為分析純）天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-F恒溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；FD-1A-80冷凍干燥機上海比朗儀器有限公司；BCD-215KS冰箱 青島海爾股份有限公司；TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；DDS-307電導率儀 上海精密科學儀器有限公司；Spetramax 2e全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；UV-5500紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小檗堿含量測定標準曲線的繪制

取5 mg小檗堿標準品，用無水乙醇溶解并定容于50 mL的容量瓶中。準確吸取1、2、3、4、5 mL于50 mL容量瓶中，無水乙醇定容。在345 nm波長處測量吸光度[16]，以小檗堿標準溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程：y＝0.032 7x+0.126 1（R2＝0.999 6）。

1.3.2 小檗堿的提取

將細葉小檗的果實在烘箱中干燥至恒質量，用高速粉碎機粉碎，過100 目篩，得到細葉小檗果實粉末，稱取10 g粉末，按照液料比32∶1加入體積分數27%的乙醇溶液，分裝至燒杯中，調節pH值依次為2.2、7.6和8.5，在功率為300 W的超聲波中分別提取50、25 min和25 min，而后抽濾得到小檗堿提取液，將小檗堿提取液在旋轉蒸發儀中蒸發濃縮，在345 nm波長處測定濃縮后提取液的吸光度，代入標準曲線計算小檗堿的質量濃度。

1.3.3 抑菌性能的測定

1.3.3.1 抑菌活性的測定

采用濾紙片法測定小檗堿對4 種細菌的抑菌活性，參照樊梓鸞等[17]的方法，用打孔器制得直徑為6 mm的濾紙片，高溫滅菌備用。在無菌條件下，將培養基倒入無菌平板，冷卻凝固，取100 μL菌懸液于培養基上涂布均勻，取4 片滅菌后的濾紙片（直徑6 mm）置于含菌平板上，其中3 片滴加10 μL質量濃度為4.10 mg/mL的小檗堿，另外一片以10 μL無菌水作為對照，細菌置于37 ℃培養箱中培養12 h，用交叉法測得抑菌圈的直徑大小。

1.3.3.2 最低抑菌濃度的測定

試管滅菌、編號，用二倍稀釋法將提取液稀釋，配制8 個梯度濃度，小檗堿的質量濃度分別為0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000 mg/mL，分別編號為1～8。96 孔板滅菌后，向每個孔內滴加20 μL（107CFU/mL）菌液，90 μL液體培養基，90 μL不同梯度濃度的提取液。以無菌水為對照，37 ℃培養12 h，每孔取100 μL涂布平板，培養12 h，觀察4 種細菌的生長情況，以第一個出現單菌落平板的樣品濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[18]。

1.3.4 生長曲線的測定

參考Liu Guorong等[19]的方法并略作修改。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的濃度稀釋為1×107CFU/mL后，加入質量濃度為一倍MIC（1 MIC）的小檗堿，對照組不加入小檗堿，向96 孔板中加入20 μL 4 種供試菌懸液，放置于37 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養箱，培養期間每隔2 h取樣，用酶標儀在660 nm波長處測定吸光度。

1.3.5 抑菌機理分析

1.3.5.1 菌體形態的觀察

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌接種于液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩培養至對數生長期，并稀釋菌液為107CFU/mL。各取3 mL菌液加入1 MIC小檗堿，對照組不加入小檗堿，在37 ℃、200 r/min搖床中培養4 h后，5 000 r/min、15 min離心收集菌體，磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0，下同）清洗3 次，加入戊二醛溶液，于4 ℃環境下放置4 h進行固定。依次使用體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液和無水乙醇進行脫水。-40 ℃下真空冷凍干燥24 h后，離子噴金，隨后進行掃描電子顯微鏡觀察[20]。

1.3.5.2 電導率的測定

將供試菌種接種于滅菌的液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩培養至對數生長期（107CFU/mL），5 000 r/min離心15 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，離心，重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入各菌種1 MIC的小檗堿，對照組用磷酸鹽緩沖溶液進行校正，放于37 ℃搖床中培養6 h，每隔1 h取出測電導率[21]。

1.3.5.3 核酸含量的測定

分別將供試菌種接種至100 mL的液體培養基中培養至對數生長期，取10 mL菌液，5 000 r/min離心15 min收集菌體，磷酸鹽緩沖溶液沖洗3 次，重新定容至10 mL，加入1 MIC的小檗堿，37 ℃恒溫搖床培養3 h。3 h后取3 mL樣品溶液于離心管中，5 000 r/min離心5 min，取其上清液在260 nm波長處測定吸光度[22]，對照組用磷酸緩沖溶液進行校正。

1.3.5.4 小檗堿對細菌蛋白質合成的影響

將1 M I C 的小檗堿加入到培養至對數生長期（107CFU/mL）的4 種供試菌的菌懸液中，對照組用磷酸緩沖溶液進行校正，37 ℃恒溫振蕩培養12 h，5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗3 次，加入20 μL上樣緩沖溶液，沸水浴5 min，離心取上清液，根據電泳樣品制備步驟進行聚丙烯酰胺凝膠電泳[23]。

1.3.5.5 細胞膜Na+/K+-ATP酶活力的測定

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌接種于滅菌的液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩培養至對數生長期（107CFU/mL），離心，棄上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗3 次，制成菌懸液，加入1 MIC的小檗堿，對照組用磷酸鹽緩沖溶液進行校正，37 ℃恒溫振蕩培養6 h，8 000 r/min離心15 min，磷酸鹽緩沖溶液清洗3 次，超聲破碎細胞（破碎條件：工作5 s、間歇15 s、共10 min，功率400 W），采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白作為標準品。用ATP酶試劑盒測定4 種供試菌中Na+/K+-ATP酶的活力，每個樣品3 次平行[24]。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2010與SPSS 20軟件進行數據統計與分析，Duncan’s多重比較分析檢驗顯著性，以P＜0.05表示差異顯著，數據處理結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 小檗堿的抑菌性能

2.1.1 小檗堿的抑菌活性及MIC

小檗堿質量濃度為4.10 mg/mL時，測定其對4 種供試菌的抑菌活性，以無菌水作對照，如表1所示。對照組無抑菌圈出現，加入小檗堿的實驗組均有抑菌圈出現，說明小檗堿對4 種供試菌均有抑制作用。大腸桿菌的MIC最小，為2.40 mg/mL，并且小檗堿對大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，為（11.60±0.11）mm，依次是金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞沙門氏菌。總體來看，小檗堿對大腸桿菌的抑菌效果更好，原因可能是大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚，結構較為致密，阻礙了小檗堿的進入。

表 1 小檗堿對4 種供試菌種的抑菌活性及MICTable 1 MICs and antimicrobial activities of berberine against 4 tested microbes

2.1.2 小檗堿對4 種供試菌生長曲線的影響

從圖1可以看出，對照組供試菌的生長曲線均為典型的S型，細菌生長穩定，均有對數生長期和穩定生長期。而加入1 MIC的小檗堿后，實驗組的4 種供試菌的生長速率均明顯降低，延滯期明顯延長，對數生長期延后，枯草芽孢桿菌無明顯對數生長期，而金黃色葡萄球菌對數生長期延后約8 h；最大生物量與對照組相比也明顯降低，基本在16 h后進入穩定期，生長曲線趨于平緩甚至有所下降。由此可見小檗堿對4 種供試菌的生長繁殖均有抑制作用，延緩其生長期，降低最高生物量，在穩定期也可抑制生長甚至導致衰亡期提前。

圖 1 小檗堿對4 種供試菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of berberine on growth curves of 4 tested bacteria

2.2 小檗堿的抑菌機理

2.2.1 小檗堿對菌體形態的影響

圖 2 小檗堿對4 種供試菌菌體形態的影響Fig. 2 Effect of berberine on cell morphology of 4 tested bacteria

由圖2可知，未添加小檗堿的4 種供試菌的菌體完整，細胞膜表面有輕微皺縮，比加入小檗堿的菌體更為圓潤飽滿，細胞膜完整，沒有破裂。當加入1 MIC的小檗堿時，4 種供試菌的菌體產生較大程度的皺縮，菌體扭曲變形，細胞膜褶皺，大腸桿菌和金黃色葡萄菌菌體細胞膜明顯破裂，導致細胞質外泄，菌體裂解死亡[25]。說明小檗堿作用于細胞膜結構，使細菌菌體受損，結構不完整從而發揮抑菌作用。

2.2.2 小檗堿對菌懸液電導率的影響

由圖3可以看出，對照組電導率增長平緩，有輕微的增長趨勢，是由于菌體細胞的自然衰亡與溶解[26]；加入小檗堿后4 種供試菌菌懸液的電導率開始增大，明顯高于對照組，電導率反映了小檗堿對菌體細胞膜通透性的影響。K+、Na+、H+等可以通過菌體細胞膜進入細胞，這些離子在維持細胞膜電位以及菌體細胞的正常代謝等方面有著重要作用，從而保障細胞的正常功能[27]。而小檗堿能使菌體細胞破裂，使菌體細胞內的離子穩態遭到破壞，細胞內電解質外泄，菌體代謝無法進行，最終導致菌體死亡。

圖 3 小檗堿對4 種菌電導率的影響Fig. 3 Effect of berberine on conductivity of 4 test bacteria

2.2.3 小檗堿對受試菌核酸溶出的影響

圖 4 小檗堿對4 種菌核酸溶出的影響Fig. 4 Effect of berberine on nucleic acid release from 4 test bacteria

如圖4所示，加入1 MIC小檗堿的實驗組菌種在260 nm波長處的吸光度與對照組相比均明顯增加。表明菌體中核酸的釋放量增大，小檗堿破壞了細胞膜的完整性，核酸等大分子物質外泄，導致細胞代謝受損，細胞失去保護，最終菌體死亡[28]，這與掃描電子顯微鏡所示的細胞受損破裂及菌懸液電導率升高的結果一致。

2.2.4 小檗堿對菌體蛋白合成的影響

圖 5 小檗堿對菌體蛋白合成的影響Fig. 5 Effect of berberine on bacterial protein synthesis

如圖5所示，加入小檗堿的實驗組與未加入小檗堿的對照組條帶有顯著差異。4 個對照組的條帶數量比實驗組多，并且清晰明顯。與對照組相比，實驗組的金黃色葡萄球菌條帶在44.3 kDa處的條帶明顯變淺；大腸桿菌在116、66.4 kDa和44.3 kDa處的條帶消失且條帶數量均減少；沙門氏菌在44.3 kDa與200 kDa之間的條帶變淺；枯草芽孢桿菌在44.3 kDa附近處的條帶變淺、較不明顯。說明小檗堿抑制了4 種供試菌細胞內蛋白的表達，對蛋白的合成具有一定的抑制作用。

2.2.5 小檗堿對細胞膜Na+/K+-ATP酶活力的影響

圖 6 小檗堿對4 種菌NaTP酶活力的影響Fig. 6 Effect of berberine on cell membrane Na+/K+-ATPase activity of 4 test bacteria

如圖6所示，加入1 MIC小檗堿的4 種供試菌的Na+/K+-ATP酶活力與對照組相比明顯降低。沙門氏菌與金黃色葡萄球菌Na+/K+-ATP酶活力下降幅度較小，1 MIC小檗堿對枯草芽孢桿菌的Na+/K+-ATP酶活力抑制效果最好，Na+/K+-ATP酶活力由（35.00±1.80）U/mg降至（4.50±0.19）U/mg。原因可能是小檗堿對蛋白有抑制作用，進而抑制了酶的活力，因此小檗堿對Na+/K+-ATP酶活力具有抑制作用[29]。

3 結 論

食品防腐劑是應用于食品工業的重要食品添加劑，主要分為天然防腐劑和化學合成防腐劑，現階段主要以化學合成防腐劑為主，其對人體健康具有潛在的危害性，因而天然食品防腐劑越來越受到人們的重視[30]。細葉小檗果中的小檗堿作為一種天然抑菌物質，可以抑制食品中常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及枯草芽孢桿菌。由本實驗可知，小檗堿對這4 種供試菌均有抑菌圈出現，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為（10.20±0.14）、（11.60±0.11）、（9.80±0.14）mm和（10.10±0.18）mm，MIC分別為3.30、2.40、3.95 mg/mL和3.60 mg/mL，對大腸桿菌的抑菌直徑最大并且具有最小的MIC，表明小檗堿對大腸桿菌的抑菌效果更好。小檗堿處理后的細菌生長曲線較平緩，對數生長期延后，阻礙了細菌的正常生長繁殖。小檗堿破壞菌體的形態，使菌體細胞破裂，胞內離子外流。同時，小檗堿能干擾菌體內蛋白的合成，抑制細胞膜Na+/K+-ATP酶的活力，影響菌體內蛋白質的積累，酶的功能受損，使其無法進行正常代謝，最終導致細菌衰亡。此外，有研究表明，一些抑菌劑如百里香酚、氯氰菊酯和氟尿嘧啶，可以與DNA結合，并可能誘導DNA二級結構和形態的變化[31]。黎芳靖[32]研究發現小檗堿能影響植物水稻細菌性條斑病菌的能量代謝，基于這些研究結果，今后有待開展小檗堿對DNA及能量代謝等方面的研究。