裸燕麥球蛋白源多肽作用于D-半乳糖致衰老小鼠的代謝組學研究

付 媛，張美莉，高韶輝，張 宇

（1.內蒙古農業大學理學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

代謝組學是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的一種研究方法，其研究對象大多是相對分子質量小于1 000的小分子物質，是20世紀90年代發展起來的一門跨領域學科[1-2]。液相色譜-質譜聯用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）技術是代謝組學研究中非常重要的一種手段和方法，近年來由于超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）的廣泛應用，UPLC與四極桿-飛行時間（quadrupole-time-of-flight，Q-TOF）MS聯用技術已經被廣泛用于代謝組學研究。代謝組學的分析中，對樣品進行提取及衍生化反應獲得相應的LC-MS總離子流圖，建立數學模型，從而獲得生物體內源性代謝產物的變量，然后利用MS中強大的譜圖解析功能或圖譜庫檢索系統進行識別分析，再對引起這些代謝物變化的生物學意義進行解釋[3-4]。

裸燕麥又稱莜麥，其富含蛋白質、不飽和脂肪酸、膳食纖維、維生素、礦物質等，是我國高寒地區重要的糧食作物之一。近年來，對于燕麥蛋白來源的抗氧化劑——燕麥肽的研究報道逐漸增多。藺瑞[5]利用堿性蛋白酶對裸燕麥球蛋白進行酶解，分別得到分子質量為1.1×104～1.3×105Da及114～861 Da的兩種組分，并且測得后者具有較強的清除O2-·、·OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力。任清等[6]將燕麥麩蛋白酶解后制備得到的抗氧化肽對DPPH自由基清除率可達57.39%。本課題組前期研究發現，裸燕麥球蛋白源多肽（peptide from naked oats globulin，PNOG）可以有效提高D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老小鼠血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，增強肝、腦組織中GSH-Px活性，降低肝、腦組織中單胺氧化酶-B（monoamine oxidase B，MAO-B）活力以及丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）含量[7]，表明PNOG可清除衰老小鼠體內過多的自由基，減少其對機體的損害。由此可見，PNOG具有強抗氧化作用，但目前對其抗氧化機制卻鮮有報道。本實驗采用UPLC-Q-TOF MS/MS分析正常對照組、衰老模型組、PNOG治療組小鼠腦組織的代謝指紋圖，并篩選出腦組織代謝中具有顯著差異的代謝標志物及作用通路。從代謝組學角度研究D-gal致衰老小鼠被PNOG干預后的代謝通路和PNOG發揮抗氧化功效的作用機制，為燕麥抗氧化作用機理的研究提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康昆明種小白鼠，雄性，體質量（20±2）g，生產許可證號：SCXK（蒙）2016-0001，購自內蒙古大學實驗動物部。

裸燕麥產于內蒙古武川縣，曬干后粉碎，過60 目篩，備用。

D-gal 美國Sigma公司；堿性蛋白酶（活力200 000 U/g） 英國BDH Chemicals有限公司；乙腈、乙酸銨、甲醇、氨水 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SQP型萬分之一分析天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；H2500R-2高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DZ-1BCII真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；TripleTOF 5600+質譜儀 美國SCIEX公司； 1290 Infinity LC UPLC系統 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 裸燕麥球蛋白源多肽的制備及結構鑒定

按本實驗室方法制備裸燕麥多肽[5]：裸燕麥粉經石油醚脫脂，10 g/100 mL NaCl溶液提取，利用堿性蛋白酶（酶用量10 000 U/g）、質量濃度5 g/100 mL底物在溫度60 ℃、pH 9.0下水解3 h，再經過Sephadex G-25凝膠柱層析分離收集抗氧化性強的組分II，經冷凍干燥，制得PNOG。并利用UPLC-MS技術對其進行氨基酸序列鑒定，所得數據提交UniProt數據庫，得到PNOG的氨基酸序列。

1.3.2 實驗動物分組及處理

參照文獻[8-10]的分組方法，昆明種健康小鼠24 只，適應性喂養一周后，隨機分為3 組，分別為正常對照組、衰老模型組、裸燕麥球蛋白源多肽（PNOG）治療組。除了正常對照組以外，其他各組按120 mg/（kgmb·d）頸背部皮下注射D-gal，正常對照組注射等量生理鹽水；PNOG治療組每日灌胃PNOG 1 000 mg/（kgmb·d），其他組灌胃等量生理鹽水。每日定時灌胃、注射一次，連續6 周，期間自由飲食飲水，觀察小鼠體征表現。

1.3.3 樣品采集與預處理

末次給藥后禁食12 h，斷頸處死，解剖小鼠，迅速取出腦組織，用4 ℃生理鹽水沖洗表面殘血，濾紙吸干水分，用液氮速冷后，樣品保存于-80 ℃冰箱中待測。

1.3.4 UPLC-MS代謝組學分析

代謝物提取：取腦組織樣本液氮研磨成粉末100 mg，加入1 mL甲醇/乙腈/水（體積比為2∶2∶1），漩渦混勻，低溫下超聲破碎30 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白質，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液進行凍干，-80 ℃保存待用。分析時加入10 μL體積分數50%乙腈溶液復溶，漩渦振蕩，4 ℃、14 000×g離心15 min，取上清液進行進樣分析。

色譜條件：采用1290 Infinity LC UPLC系統，使用HILIC色譜柱進行分離。進樣量10 μL、柱溫25 ℃、流速0.3 mL/min；色譜流動相A：水+乙酸銨（0.025 mol/L）+氨水（0.025 mol/L）、流動相B：乙腈；色譜梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～9 min，65%～40% B；9～10 min，40% B；10～11.1 min，40%～95% B；11.1～16 min，95% B。同時樣本隊列中插入質控樣本（quality control，QC），用于監測系統的穩定性及數據的可靠性。

質譜條件：樣品分別采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）進行正離子和負離子模式檢測。樣品經過UPLC分離后用TripleTOF 5600質譜儀基于信息采集（information dependent acquisition ，IDA）功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子采集對應的二級質譜數據。轟擊能量：30 eV。ESI離子源參數設置如下：霧化氣壓60 Pa、輔助氣壓60 Pa、氣簾氣壓30 Pa、輔助氣壓60 Pa、溫度600 ℃、噴霧電壓±5.5 kV（正負離子模式）。

1.4 數據統計與分析

U P L C-Q-T O F M S/M S 采集的原始數據經ProteoWizard程序轉換格式，再經XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。采用精確質量數匹配和二級譜圖匹配的方式檢索Metlin、HMDB和MassBank數據庫對代謝物進行結構鑒定。對XCMS提取得到的數據應用SIMCA-P 14.1程序進行模式識別，再經Pareto-scaling程序預處理后，進行無監督主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal projection to latent structures，OPLS-DA）。以OPLS-DA模型得到的變量權重值（variable importance for the projection，VIP）大于1為篩選標準，初步篩選出各組間的差異物。再進一步采用單變量統計分析，得到P值。選擇VIP＞1且P＜0.05的代謝物作為具有顯著性差異的代謝物；而VIP＞1且0.05＜P＜0.1則作為差異代謝物。將得到的顯著性差異代謝物進行KEGG ID Mapping，并提交到KEGG網站進行相關通路分析。

2 結果與分析

2.1 PNOG結構鑒定結果

圖 1 PNOG的二級質譜圖Fig. 1 Tandem mass spectrum of PNOG

通過UPLC-MS/MS技術分析PNOG結構，其結果如圖1所示，將質譜圖結果提交Uniprot數據，經鑒定，PNOG的氨基酸序列為：苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-亮氨酸（Phe-Leu-Trp-Gly-Thr-Leu，FLWGTL）。

國內外很多研究發現，抗氧化肽中Leu殘基出現的頻率比較高[11-13]，本實驗中測得PNOG的氨基酸序列為Phe-Leu-Trp-Gly-Thr-Leu，Leu出現頻率也非常高，故而PNOG的抗氧化性可能與此有關。Leu是一種調節因子，楊力源[14]研究發現，Leu可通過抑制促炎細胞因子的表達，起到抗氧化、延緩機體衰老的作用。Rojas-Ronquillo等[15]研究發現，苯丙氨酸等芳香族氨基酸暴露在兩端的多肽表現出更好的抗氧化性；Babini等[16]研究發現色氨酸是抗氧化肽中典型氨基酸之一，這可能是由于苯丙氨酸和色氨酸均具有苯環，具有供氫能力，能減緩自由基鏈式反應。

2.2 小鼠腦組織UPLC-Q-TOF MS分析結果

圖 2 UPLC-Q-TOF MS采集的小鼠腦樣品典型總離子流色譜圖Fig. 2 Typical total ion current chromatograms of metabolites in brain tissues obtained by UPLC-Q-TOF MS

采用UPLC-Q-TOF MS在正離子模式下采集腦組織樣本的代謝信息，其中圖2D為質控樣本在正離子模式下的總離子流圖，結果表明各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，表明實驗誤差小、數據可靠。從圖2A～C總離子流圖上可以看出各組色譜峰保留時間基本一致，同一時間色譜峰高度有差別，表明正常對照組、衰老模型組與PNOG治療組小鼠腦組織中內源性代謝物含量出現了差異，即表示代謝模式發生了變化。

圖 3 小鼠腦樣本的PCA得分圖Fig. 3 PCA score plots of mouse brain samples

圖 4 衰老模型組和對照組小鼠腦樣本的OPLS-DA得分圖（A）及置換檢驗圖（B）Fig. 4 OPLS-DA score plot (A) and permutation test chart (B) of mouse brain samples between aging model and control groups

將經過預處理的UPLC-Q-TOF MS數據進行PCA，獲得各個小鼠腦樣本在空間上的分布情況，由圖3可知，質控樣本較為緊密地聚集在一起，表明本實驗的重復性良好，實驗數據穩定可靠，在實驗中獲得的代謝譜差異能反映樣本間本身的生物學差異。正常對照組與衰老模型組以及衰老模型組與PNOG治療組各樣本明顯分離，顯示出顯著差異，說明小鼠經過連續6 周頸背部皮下注射120 mg/（kgmb·d）D-gal造模后，其腦組織中內源性代謝物發生了明顯變化，出現了代謝紊亂。另外，PNOG治療組各樣本點顯示出不同程度地向正常對照組靠近的趨勢，說明灌胃PNOG后，可有效調節衰老小鼠體內的代謝紊亂，起到抗氧化作用。

圖 5 PNOG治療組和衰老模型組小鼠腦樣本的OPLS-DA得分圖（A）及置換檢驗圖（B）Fig. 5 OPLS-DA Score plots (A) and permutation test charts (B) of mouse brain samples between PNOG and aging model groups

為了進一步驗證正常對照組、衰老模型組和PNOG治療組小鼠腦樣本的分離情況，并從中識別出標志代謝物，對各數據組進行OPLS-DA分析，對腦組織樣本的代謝全譜進行區分，其得分圖及置換檢驗見圖4、5。其中，由圖4B可知，R2X(cum)＝0.7、R2Y(cum)＝0.998、Q2(cum)＝0.894，即表明可以用70%的變量解釋了99.8%的組間差異，預測能力為89.4%；由圖5B可知，R2X(cum)＝0.452、R2Y(cum)＝0.934、Q2(cum)＝0.681，均具有較高的解釋率和預測率，表明該模型是可靠的。

圖 6 PNOG治療組對比衰老模型組小鼠腦樣本正離子模式下的火山圖Fig. 6 Volcano plot of PNOG-treatment versus aging model groups under positive ion mode

在進行兩組樣本間的差異代謝物分析時，火山圖是常用的單變量分析方法。圖6為衰老模型組與PNOG治療組正離子模式數據的火山圖，圖中藍色點為變異倍數（fold change，FC）＞2或FC＜0.5且P＜0.05的代謝物，即篩選出的差異代謝物。

2.3 層次聚類分析結果

圖 7 PNOG治療組對比衰老模型組小鼠腦樣本顯著性差異代謝物層次聚類結果Fig. 7 Heat map for brain metabolites in PNOG-treated versus aging model groups

對各組樣本進行層次聚類分析可更直觀地顯示樣本之間的關系以及代謝物在不同樣本中的表達模式上的差異，圖7顯示了PNOG治療組與衰老模型組兩組樣本間進行比較的顯著性差異代謝物層次聚類結果。可以看出，衰老模型組與PNOG治療組的樣本很明顯地分為兩簇，兩組間的主要差異代謝物有磷脂、脂肪酸、氨基酸、嘌呤代謝物等，同時也提示PNOG抗氧化的機制可能會涉及到甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、嘌呤代謝、氨基酸代謝等代謝途徑。

2.4 顯著差異代謝物篩選及相關通路分析結果

利用OPLS-PA模型的VIP值并結合火山圖及聚類分析法，篩選出顯著差異代謝物并進行KEGG ID Mapping，并提交到KEGG網站進行相關通路分析，結果如表1所示。

表 1 衰老模型組、正常對照組及PNOG組顯著差異代謝物篩選Table 1 Screening of differentially expressed metabolites among aging model, control and PNOG-treated groups

與衰老模型組相比，PNOG治療組小鼠腦組織中乙酰膽堿、甘油磷酸膽堿、胞苷5’-二磷酸（cytidine 5’-diphosphocholine，CDP）-膽堿、溶血磷脂酰膽堿、sn-甘油3-磷酸乙醇胺、L-肉堿、L-棕櫚酰肉堿、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、腺苷5’-二磷酸（adenosine 5’-diphosphate，ADP）、次黃嘌呤核苷酸（inosine 5’-monophosphate，IMP）、3-甲基硫代丙酸鹽、N-乙酰天冬氨酰氨基甲酸（N-acetylaspartylglutamate，NAAG）這13 種物質含量升高；腺嘌呤、腺苷、尿酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸這4 種物質含量降低；而與正常對照組相比，衰老模型組小鼠腦樣本的顯著差異代謝物含量的變化趨勢恰好與其相反。結果顯示，這17 種顯著差異代謝物涉及了甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、嘌呤代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、神經活性配體-受體相互作用等途徑。

乙酰膽堿是腦組織中重要的神經遞質，發揮著調節學習記憶功能的作用[17-18]。隨著衰老的發生，體內產生的大量自由基會對膽堿乙酰化轉移酶等蛋白質進行攻擊，進而影響乙酰膽堿的合成，乙酰膽堿含量的降低會造成學習記憶能力的減退[17]。本實驗結果表明，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中的乙酰膽堿含量顯著降低（FC＝0.78，且P＜0.01），說明D-gal致衰老小鼠膽堿系統功能降低。長期灌胃一定量的PNOG可顯著提高衰老小鼠腦組織中乙酰膽堿含量（FC＝1.32，且P＜0.01），說明PNOG可清除體內大量活性氧，減緩膽堿乙酰化轉移酶等的氧化損傷，提高小鼠體內的抗氧化能力。

甘油磷酸膽堿是生物合成乙酰膽堿的重要前體[19-20]；CDP-膽堿是生物合成磷脂酰膽堿時的中間體，磷脂酰膽堿是構成生物細胞膜的主要成分，且其在腦神經細胞中約占17%～20%[21-23]。大腦可直接從血液中攝取磷脂酰膽堿及膽堿，并將其迅速轉化為乙酰膽堿，從而提高腦細胞的活性、改善腦功能[24]。本實驗結果表明，灌胃PNOG后，可明顯改善甘油磷脂代謝，顯著提高D-gal致衰老小鼠體內甘油磷酸膽堿及CDP-膽堿的含量（FC分別為2.41和1.31，且P＜0.01），從而進一步提高腦組織中乙酰膽堿的含量，提高大腦的學習記憶能力，延緩衰老。

溶血磷脂酰膽堿是磷脂的降解產物，其含量的異常很大程度上意味著磷脂代謝的紊亂。溶血磷脂酰膽堿不僅與維持細胞膜結構的完整性和穩定性密切相關，還可以作為第二信使參與細胞多種信號轉導過程[25]。溶血磷脂酰膽堿的含量隨年齡增加而減少也可能與細胞的凋亡機制有關，或者是在提示機體內存在能量代謝障礙和氧化損傷[26-27]。本實驗結果表明，與正常對照組相比D-gal致衰老小鼠體內溶血磷脂酰膽堿含量降低（FC為0.87，且P＜0.05），而灌胃PNOG后，D-gal致衰老小鼠體內其含量有所升高（FC為1.13，且P＜0.05），說明PNOG可有效改善D-gal致衰老小鼠機體內的磷脂代謝紊亂、能量代謝障礙及氧化損傷。

肉堿在脂肪酸代謝中必不可少，脂肪酸必須借助肉堿才能進入線粒體發生β氧化；EPA不僅是大腦的重要營養成分，而且可以保持細胞膜的流動性及通透性以維持細胞的正常生理功能，促進脂肪酸的β氧化[28-30]。本實驗中，衰老模型小鼠腦組織中肉堿及不飽和脂肪酸的含量均降低，表明可能存在脂肪酸代謝異常；而灌胃PNOG后，小鼠體內L-肉堿、L-棕櫚酰肉堿、EPA含量顯著上升（FC分別為1.12、1.46和1.47，且P＜0.05），提示PNOG可改善D-gal致衰老小鼠的脂肪酸代謝異常。

在正常機體代謝中，在半乳糖激酶的作用下，半乳糖與ATP反應生成半乳糖-1-磷酸和ADP；在半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶及尿苷二磷酸4位差向異構酶作用下，半乳糖-1-磷酸可生成葡萄糖-1-磷酸參與葡萄糖代謝。但過量供給D-gal時，在半乳糖激酶的作用下，半乳糖磷酸化時會消耗大量ATP，生成大量ADP，ADP進一步形成AMP，AMP大量增加，嘌呤代謝酶系統被激活，AMP在核苷酶作用下，生成腺苷，腺苷在腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）的作用下生成IMP，進而其在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的作用下生成尿酸[31-32]。尿酸雖然可以將體內部分自由基清除，但是，由于其具有特殊的環狀結構，更容易產生氧化性更強的自由基，導致細胞的損傷[33-34]。衰老模型組小鼠與正常組小鼠對比，體內腺苷、腺嘌呤含量都明顯增大，表明衰老模型組小鼠體內出現腺嘌呤代謝紊亂。越來越多的研究顯示，嘌呤的代謝紊亂在許多神經系統疾病的發病機制中起關鍵作用[32-34]。當灌胃PNOG后，D-gal致衰老小鼠體內腺苷、腺嘌呤以及尿酸含量明顯下降（FC分別為0.34、0.28和0.64，且P＜0.01），ADP、AMP、IMP含量明顯升高（FC分別為1.41、1.35和1.32，且P＜0.05），說明PNOG可以通過調控核苷酶減緩AMP生成腺苷的速度，使腺苷、腺嘌呤、尿酸的含量明顯降低，從而使腺嘌呤代謝趨于正常。

S-腺苷-L-同型半胱氨酸脫去腺苷后，即可形成同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）。研究表明，HCY是一種興奮性氨基酸，通過激活代謝型谷氨酸或離子型受體，造成鈣離子內流，從而損傷線粒體及激活蛋白酶、磷酸酯酶等，導致細胞代謝障礙[35-36]。灌胃PNOG后，可有效降低機體內S-腺苷-L-同型半胱氨酸的含量（FC為0.72，且P＜0.05），對神經系統起到保護作用。

NAAG是一種重要的內源性神經保護遞質，具有極強的抑制谷氨酸釋放的作用[37]；而谷氨酸的過度釋放可導致細胞的衰老、死亡[38-39]。與衰老模型組小鼠相比，灌胃PNOG后，小鼠體內NAAG含量明顯提高（FC為1.98，且P＜0.01），可有效抑制谷氨酸的過度釋放，起到延緩衰老的作用。

實驗結果表明灌胃PNOG后，D-gal致衰老小鼠代謝通路的紊亂都得到了改善，從代謝組學的角度驗證了PNOG可清除體內過多的自由基，起到抗衰老、抗氧化的作用，這可能與PNOG的氨基酸序列中Leu出現頻率高、Phe出現在C端以及序列中出現Trp有關。

3 結 論

采用基于UPLC-Q-TOF MS的代謝組學方法，并結合多元統計學研究了D-gal致衰老小鼠在PNOG干預下的腦組織代謝變化，共篩選出17 種顯著差異代謝物及其參與的6 條代謝通路，揭示了灌胃PNOG后對D-gal致衰老小鼠體內代謝紊亂干預的作用機制。結果表明：PNOG可通過升高小鼠腦組織中乙酰膽堿、甘油磷酸膽堿、溶血磷脂酰膽堿、CDP-膽堿、sn-甘油3-磷酸乙醇胺含量，從而改善D-gal致衰老小鼠體內甘油磷脂代謝；可通過升高L-肉堿、L-棕櫚酰肉堿含量，從而促進脂肪酸的β氧化，并使紊亂的脂肪酸代謝得到恢復；可通過改善不飽和脂肪酸的生物合成來升高EPA含量，提高機體清除自由基的能力；另外，PNOG可通過調節嘌呤代謝，從而降低腺嘌呤、腺苷、尿酸含量，緩解衰老小鼠的體內的氧化應激；PNOG還可通過調節半胱氨酸和蛋氨酸代謝、神經活性配體-受體相互作用，從而降低S-腺苷-L-同型半胱氨酸含量，升高小鼠體內NAAG含量，對小鼠的神經系統起到保護作用，延緩衰老、抗氧化。