硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用

郭 都，趙宇陽(yáng)，王瑞霞，王 碩，夏效東，石 超

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種新興的食源性致病菌，直至2008年才被科學(xué)定義和分類[1]。阪崎克羅諾桿菌是一種革蘭氏陰性、無(wú)芽孢、周身鞭毛的條件性致病菌[2]。該菌廣泛分布于奶粉、水果以及蔬菜等食品中，流行病學(xué)研究表明嬰幼兒奶粉是其可能的傳播途徑[3]。它可導(dǎo)致新生兒或早產(chǎn)兒出現(xiàn)危及生命的腦膜炎、菌血癥以及壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，致死率高達(dá)80%[4]。即使此類由阪崎克羅諾桿菌感染引起的相關(guān)疾病被治愈，患者仍存在患有神經(jīng)性發(fā)育遲緩、腦積水、四肢癱瘓等嚴(yán)重后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，預(yù)防及控制阪崎克羅諾桿菌的感染對(duì)于保障嬰幼兒健康具有重要意義。

使用抗生素是治療和預(yù)防致病菌感染常見的方法，然而隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，一些抗生素對(duì)這些菌株不再有效[6]。近年來，將植物源活性物質(zhì)用于控制由致病菌引起的感染成為研究熱點(diǎn)[7]。硫辛酸是一種天然的抗氧化劑，它能夠螯合金屬、消除活性物質(zhì)從而修復(fù)細(xì)胞的氧化損傷。最初，硫辛酸被認(rèn)為是一種維生素，廣泛存在于菠菜、西蘭花、番茄、豌豆、豆芽以及米糠中，其在人體血清中質(zhì)量濃度約為16 mg/L[8-9]。研究表明硫辛酸對(duì)于糖尿病、肝損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有一定的治療潛力，已被一些國(guó)家作為膳食補(bǔ)充劑用于防治上述疾病[10]。研究表明，硫辛酸可通過改變阪崎克羅諾桿菌胞內(nèi)pH值、降低胞外ATP、使細(xì)胞膜電位發(fā)生去極化從而抑制阪崎克羅諾桿菌[9]。此外，Kubra等[11]發(fā)現(xiàn)4 mmol/L硫辛酸對(duì)銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的抑制率為28%。然而，硫辛酸對(duì)于其他細(xì)菌的抑制效果和機(jī)理鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探究硫辛酸對(duì)于阪崎克羅諾桿菌體外感染能力的抑制作用。

基于以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)通過評(píng)價(jià)硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入腸上皮細(xì)胞能力以及在巨噬細(xì)胞中存活及增殖能力的影響，共同探究硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用，以期為硫辛酸作為膳食補(bǔ)充劑預(yù)防或控制由阪崎克羅諾桿菌引起的相關(guān)食源性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544、29004和12868購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。阪崎克羅諾桿菌分離菌株6-16、15-7和18-11由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物安全實(shí)驗(yàn)室從嬰幼兒奶粉及米粉中分離得到[12]。人克隆結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞（Caco-2）、小鼠巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）購(gòu)于武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。

硫辛酸（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)有限公司；Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）細(xì)胞培養(yǎng)液 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 以色列Biological Industries公司；慶大霉素 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（純度≥99.5%）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；5 8 0 4 R 低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)E p p e n d o r f公司；HF90 CO2恒溫培養(yǎng)箱 上海力申科技儀器有限公司；GHX-9050B-2細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Model 680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌液制備

將凍存于-80 ℃冰箱的阪崎克羅諾桿菌平板劃線于TSA培養(yǎng)基上并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化。隨后挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，將接種了阪崎克羅諾桿菌的培養(yǎng)液置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h（130 r/min）。將培養(yǎng)后的菌懸液4 ℃、5 000×g離心5 min，去除上清液，隨后使用pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次。最后用PBS重新懸浮菌體沉淀，并調(diào)整菌懸液在600 nm波長(zhǎng)處的光密度值（OD600nm）為0.50±0.05，使菌液濃度約為108CFU/mL，備用。

1.3.2 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌最小抑菌濃度的測(cè)定

硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定參考Chen Huaiqiong等[13]所用的肉湯稀釋法，并略有修改。具體方法如下：使用TSB培養(yǎng)基將1.3.1節(jié)所得菌液濃度調(diào)整至5×105CFU/mL。隨后使用DMSO配制硫辛酸溶液，將配制好的硫辛酸溶液溶解于TSB培養(yǎng)基中，利用等倍稀釋法配制不同濃度的硫辛酸溶液，并與上述菌液等體積混合使得硫辛酸終質(zhì)量濃度為5.00、2.50、1.25、0.625、0.312 5、0 mg/mL（對(duì)照組，CK）（DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.5%）。將混合好的細(xì)菌-硫辛酸混合液以每孔200 μL的體積加入至96 孔板中。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置含有體積分?jǐn)?shù)0.5% DMSO的TSB培養(yǎng)基作為背景空白對(duì)照組以扣除溶劑對(duì)OD值造成的影響。此時(shí)，將樣品置于酶標(biāo)儀中測(cè)定各組樣品在630 nm波長(zhǎng)處的OD值。隨后，將樣品置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后再次測(cè)定OD630nm。經(jīng)培養(yǎng)24 h后，OD值變化小于0.05所對(duì)應(yīng)最小的硫辛酸質(zhì)量濃度即為硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌的MIC。

1.3.3 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌亞抑制濃度的測(cè)定

硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌亞抑制濃度（sub-minimum inhibitory concentration，SIC）的測(cè)定參照Shi Chao等的方法[14]。按1.3.1節(jié)的方法制備阪崎克羅諾桿菌菌懸液。向百孔板每孔中加入125 μL菌懸液（約106CFU/mL），隨后每孔加入125 μL使用TSB培養(yǎng)基配制的硫辛酸溶液，使硫辛酸質(zhì)量濃度分別為480、240、120、60、30、15、7.5、3.75 μg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不添加硫辛酸的菌懸液作為對(duì)照組（CK），并設(shè)置TSB培養(yǎng)基作為背景空白對(duì)照組。將樣品置于微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，于37 ℃下每隔1 h測(cè)定24 h內(nèi)各孔樣品在波長(zhǎng)600 nm波長(zhǎng)處的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線，并選擇對(duì)阪崎克羅諾桿菌生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用的濃度作為硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌的SIC。

1.3.4 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌運(yùn)動(dòng)能力的影響

硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌泳動(dòng)及群集運(yùn)動(dòng)能力影響的測(cè)定參照Li Guanghui等[15]的方法。首先，配制泳動(dòng)營(yíng)養(yǎng)平板（含0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂LB肉湯）和群集營(yíng)養(yǎng)平板（含0.5%瓊脂、0.5%葡萄糖LB肉湯），將配制好的溶液加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌。待培養(yǎng)基溫度降低至45 ℃左右時(shí)，向其中加入硫辛酸，使硫辛酸終質(zhì)量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL并充分混勻后倒入培養(yǎng)皿（直徑90 mm）。待培養(yǎng)基冷卻后，吸取5 μL 1.3.1節(jié)中制備的菌懸液分別接種至泳動(dòng)平板和群集平板中央，于37 ℃分別培養(yǎng)7 h和18 h。隨后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并記錄阪崎克羅諾桿菌向周圍運(yùn)動(dòng)所形成的面積。

1.3.5 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力的影響

參考Naves等[16]的方法，按1.3.1節(jié)的方法制備阪崎克羅諾桿菌菌懸液，并使用TSB調(diào)節(jié)菌懸液OD600nm＝1（濃度約為109CFU/mL）。隨后，向上述菌懸液中加入硫辛酸溶液使其終質(zhì)量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL。隨后，將各組樣品轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔250 μL。于25 ℃下培養(yǎng)48 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔樣品在630 nm波長(zhǎng)處的OD值。隨后，吸除菌液并使用無(wú)菌水將各孔漂洗一次，烘干后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%結(jié)晶紫溶液對(duì)生物被膜進(jìn)行染色并使用無(wú)菌水漂洗未與生物被膜結(jié)合的結(jié)晶紫染料，烘干后使用體積分?jǐn)?shù)33%冰乙酸溶液溶解生物被膜-結(jié)晶紫復(fù)合物。最后，測(cè)定每孔樣品在570 nm波長(zhǎng)處的OD值。使用OD570nm與OD630nm的比值表示阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力指數(shù)（specific biofilm formation，SBF），其中OD570nm反映生物被膜形成量，OD630nm反映菌懸液中細(xì)菌的數(shù)量。

1.3.6 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的影響

硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力影響的測(cè)定參照Amalaradjou等[17]的方法略有修改。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的濃度接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)18 h，并使用PBS輕柔清洗兩次。菌懸液制備同1.3.1節(jié)，向其中添加硫辛酸溶液使得各組終質(zhì)量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL。隨后將各組樣品置于37 ℃搖床培養(yǎng)6 h（130 r/min）后，4 ℃、5 000×g離心5 min，并使用PBS清洗2 次。使用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL。隨后，將制備好的阪崎克羅諾桿菌接種于準(zhǔn)備好的Caco-2細(xì)胞中，使得感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為10，600×g離心5 min，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)1 h。

黏附實(shí)驗(yàn)：去除細(xì)胞上清液，使用PBS輕柔清洗3 次。向每孔加入0.1%（體積分?jǐn)?shù)）Triton X-100，置于4 ℃孵育20 min以裂解細(xì)胞。收集所有液體進(jìn)行10 倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，將樣品置于37 ℃培養(yǎng)24 h后讀數(shù)。黏附率以處理組黏附菌量與CK組黏附菌量的比值表示。

侵入實(shí)驗(yàn)：去除細(xì)胞上清液，使用PBS輕柔清洗一次。向每孔加入含有100 μg/mL慶大霉素的1%FBS-DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)30 min。隨后去除細(xì)胞上清液，使用PBS輕柔清洗3 次后，向每孔加入0.1% Triton X-100，置于4 ℃孵育20 min以裂解細(xì)胞。收集所有液體進(jìn)行10 倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，將樣品置于37 ℃培養(yǎng)24 h后讀數(shù)。侵入率以處理組侵入菌量與CK組侵入菌量的比值表示。

1.3.7 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌在小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7中存活及增殖能力的影響

本實(shí)驗(yàn)參照Shi Chao等[18]的方法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞以1×105細(xì)胞/mL的濃度接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)12 h，使用無(wú)菌PBS輕柔清洗3 次。菌懸液制備同1.3.1節(jié)，向其中添加硫辛酸溶液使得各組終質(zhì)量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL。隨后將各組樣品置于37 ℃搖床培養(yǎng)6 h（130 r/min）后，離心（5 000×g，5 min，4 ℃）并使用PBS清洗2 次。使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)液調(diào)整菌懸液濃度為106CFU/mL。隨后，將制備好的阪崎克羅諾桿菌接種于準(zhǔn)備好的RAW 264.7細(xì)胞中，使得MOI為10，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)45 min后，吸除孔板中的液體，并使用PBS清洗1 次；向每孔加入含有100 μg/mL慶大霉素的1% FBS-DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)30 min。去除細(xì)胞上清液，使用PBS清洗一次。向每孔加入含有10 μg/mL慶大霉素的1% FBS-DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境下分別培養(yǎng)0、24、48、72 h。于對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，取出孔板并去除每孔細(xì)胞上清液，使用PBS清洗3 次。向每孔加入0.1% Triton X-100，置于4 ℃孵育20 min以裂解細(xì)胞。收集所有菌體進(jìn)行10 倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，將樣品置于37 ℃培養(yǎng)24 h后讀數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 19.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性比較。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌的MIC

表 1 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌的MICTable 1 MICs of LA against C. sakazakii strains

如表1所示，硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌3 株標(biāo)準(zhǔn)菌株及3 株分離菌株的MIC均為5.00 mg/mL。因此，硫辛酸可有效抑制阪崎克羅諾桿菌。由于阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544具有泳動(dòng)群集運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入腸上皮細(xì)胞能力以及在巨噬細(xì)胞中存活及增殖能力等毒力因子表型和基因?qū)W特征[19]，因此選擇菌株ATCC 29544作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.2 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的SIC

圖 1 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 1 Effect of LA on the growth curve of C. sakazakii ATCC 29544

由圖1可知，480、240、120 μg/mL硫辛酸可顯著抑制阪崎克羅諾桿菌的生長(zhǎng)。當(dāng)硫辛酸質(zhì)量濃度低于60 μg/mL時(shí)，在24 h內(nèi)，硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌的生長(zhǎng)曲線沒有明顯影響，因此，本研究選擇60、30 μg/mL作為硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌的SIC。

2.3 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544運(yùn)動(dòng)能力的影響

如圖2所示，未使用硫辛酸處理的阪崎克羅諾桿菌其泳動(dòng)圈面積為（24.91±0.72）cm2，經(jīng)30、60 μg/mL硫辛酸處理后，阪崎克羅諾桿菌泳動(dòng)圈面積分別極顯著下降至（21.06±0.80）cm2和（18.40±1.04）cm2（P＜0.01）。因此，硫辛酸可以抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)能力，且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

圖 2 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544泳動(dòng)能力的影響Fig. 2 Effect of LA on swimming motility of C. sakazakii ATCC 29544

圖 3 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544群集能力的影響Fig. 3 Effect of LA on swarming motility of C. sakazakii ATCC 29544

由圖3可知，30 μg/mL的硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌群集運(yùn)動(dòng)面積無(wú)顯著影響（P＞0.05）。60 μg/mL的硫辛酸可顯著減小阪崎克羅諾桿菌的群集運(yùn)動(dòng)圈面積，其面積極顯著下降至CK組的71.41%（P＜0.01）。

2.4 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544生物被膜形成能力的影響

如圖4所示，結(jié)果表明硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌的生物被膜形成能力。未經(jīng)硫辛酸處理的阪崎克羅諾桿菌SBF為2.31±0.26，經(jīng)質(zhì)量濃度為15 μg/mL的硫辛酸處理后，阪崎克羅諾桿菌SBF極顯著下降至1.94±0.06（P＜0.01）。經(jīng)質(zhì)量濃度為30、60 μg/mL的硫辛酸處理后，其生物被膜形成量分別極顯著下降為CK組的82%和79%（P＜0.01）。

圖 4 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544生物被膜形成能力的影響Fig. 4 Effect of LA on biofilm-forming capacity of C. sakazakii ATCC 29544

2.5 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的影響

圖 5 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544黏附（A）及侵入（B）Caco-2細(xì)胞能力的影響Fig. 5 Effect of LA on the ability of C. sakazakii ATCC 29544 to adhere (A)and invade (B) Caco-2 cells

由圖5A可知，SIC（60、30 μg/mL）的硫辛酸可極顯著抑制阪崎克羅諾桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力（P＜0.01）。經(jīng)30、60 μg/mL的硫辛酸作用后，阪崎克羅諾桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附量分別下降至CK組的70.93%和53.27%。在侵入實(shí)驗(yàn)中（圖5B），30 μg/mL的硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌侵入細(xì)胞能力無(wú)顯著影響（P＞0.05）。60 μg/mL的硫辛酸可將侵入Caco-2細(xì)胞的阪崎克羅諾桿菌數(shù)量極顯著下降至CK組的72.00%（P＜0.01）。綜上所述，硫辛酸可有效抑制阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力。

2.6 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544在RAW 264.7細(xì)胞中存活及增殖能力的影響

由圖6可知，CK組中阪崎克羅諾桿菌在72 h內(nèi)仍可在巨噬細(xì)胞中存活，并且在24～72 h內(nèi)，阪崎克羅諾桿菌在巨噬細(xì)胞中存活并進(jìn)行增殖。經(jīng)質(zhì)量濃度為30、60 μg/mL的硫辛酸處理后，阪崎克羅諾桿菌在72 h內(nèi)在巨噬細(xì)胞中的存活量均有下降。且在72 h時(shí)，硫辛酸極顯著降低了阪崎克羅諾桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活量（P＜0.01）。綜上所述，SIC的硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌在巨噬細(xì)胞RAW 264.7中存活及增殖能力。

圖 6 硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544在巨噬細(xì)胞RAW 264.7中存活及增殖能力的影響Fig. 6 Effect of LA on survival and replication of C. sakazakii ATCC 29544 in RAW 264.7 cells

3 討 論

細(xì)菌的感染能力與多種因素有關(guān)，其中菌體運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力、黏附及侵入宿主腸上皮細(xì)胞能力以及在巨噬細(xì)胞中存活及增殖能力等被認(rèn)為是阪崎克羅諾桿菌感染宿主、造成宿主嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染的重要原因[20]。本研究首先測(cè)定得出硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌3 株標(biāo)準(zhǔn)菌株和3 株分離菌株的MIC均為5.00 mg/mL（表1）。隨后確定硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的SIC為30、60 μg/mL（圖1）。在此基礎(chǔ)上，本研究在不影響阪崎克羅諾腸桿菌存活及生長(zhǎng)的條件下，從阪崎克羅諾桿菌運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入宿主細(xì)胞能力以及在巨噬細(xì)胞中存活及增殖能力4 個(gè)方面，共同探究硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌感染能力的體外抑制作用。

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性與其對(duì)宿主的感染能力有著密切的聯(lián)系，對(duì)其初步侵入并感染宿主細(xì)胞起到關(guān)鍵作用[21]。細(xì)菌依靠鞭毛運(yùn)動(dòng)定向侵入及作用于宿主細(xì)胞，因而運(yùn)動(dòng)性是致病菌一項(xiàng)重要的毒力因子，抑制致病菌的運(yùn)動(dòng)性是控制致病菌感染的有效途徑[22]。本研究中，硫辛酸在SIC（30、60 μg/mL）下可抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)及群集運(yùn)動(dòng)能力（圖2、3）。前期研究結(jié)果表明，檸檬醛與百里醌在SIC下也可抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)及群集運(yùn)動(dòng)能力[18-19]。類似地，100 μg/mL質(zhì)量濃度的姜黃素可抑制副溶血性弧菌、哈維氏弧菌以及創(chuàng)傷弧菌的泳動(dòng)和群集運(yùn)動(dòng)能力[23]。Bai Jinrong等證明0.312 5、0.625、1.25 mg/mL質(zhì)量濃度的莽草酸可抑制金黃色葡萄球菌的運(yùn)動(dòng)能力[24]。在本研究中，硫辛酸抑制了阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)及群集運(yùn)動(dòng)能力，從而一定程度上降低了阪崎克羅諾桿菌在侵染初期對(duì)宿主細(xì)胞的定向侵入能力。

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性在細(xì)菌黏附植物或動(dòng)物組織表面過程中起到了重要的作用。細(xì)菌可通過這種能夠附著在有生命或無(wú)生命材料表面的能力形成生物被膜，從而為細(xì)菌提供一定的物理保護(hù)屏障，使其能夠抵抗多種外界壓力，如熱、滲透壓、消毒劑以及抗生素等[25]。阪崎克羅諾桿菌可附著于塑料、玻璃、不銹鋼以及硅膠等介質(zhì)表面生長(zhǎng)并形成生物被膜，該生存方式能夠抵抗消毒劑的清除作用，增加易感人群感染的幾率[7,26]。因此，抑制阪崎克羅諾桿菌生物被膜的形成能力有利于降低人體感染該菌的風(fēng)險(xiǎn)。本研究利用結(jié)晶紫可與生物被膜中胞外聚合物結(jié)合的特性，評(píng)價(jià)硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力的影響（圖4）。類似地，Brackman等[27]使用經(jīng)典結(jié)晶紫染色法證明肉桂醛可降低弧菌生物被膜的形成量。Kang Jiamu等[28]利用結(jié)晶紫染色法證明0.25～2.00 mg/mL質(zhì)量濃度的沒食子酸可顯著抑制福氏志賀菌生物被膜形成量。Fan Qiuxia等[29]利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡定性觀察得到CoQ0可有效降低單增李斯特菌形成過程中的生物被膜黏附菌量。在本研究中，SIC的硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力，從而一定程度上降低其對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力。Hartmann等[30]研究表明，鞭毛的缺失可大大降低細(xì)菌的附著能力，因此，硫辛酸對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力及生物被膜形成能力的抑制作用是否是通過降低阪崎克羅諾桿菌鞭毛合成相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，有待進(jìn)一步探究。

致病菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用被認(rèn)為是多數(shù)感染性疾病的起因，有研究表明，致病菌的黏附作用可使其依附于宿主細(xì)胞表面，避免被宿主的清潔機(jī)制清除[31]。同時(shí)黏附作用可使致病菌進(jìn)一步侵入宿主細(xì)胞及組織進(jìn)而引發(fā)宿主的感染[20,32]。經(jīng)口攝入的阪崎克羅諾桿菌可通過黏附腸上皮細(xì)胞、穿越腸道屏障、侵入血管和宿主免疫系統(tǒng)從而穿透血腦屏障破壞宿主體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)進(jìn)而引起宿主嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染[20]。因此，阪崎克羅諾桿菌黏附并侵入宿主腸上皮細(xì)胞是引發(fā)系統(tǒng)性感染的第一步。研究表明，阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544可黏附并侵入Caco-2細(xì)胞[33]。在本研究中，硫辛酸可有效抑制阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力（圖5）。Amalaradjou等[17]證明肉桂醛可抑制阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入宿主細(xì)胞人小腸上皮細(xì)胞INT 407、Caco-2細(xì)胞、大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞BMEC細(xì)胞的能力。類似地，Li Guanghui等[15]發(fā)現(xiàn)SIC的安石榴苷可降低黏附及侵入人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的鼠傷寒沙門氏菌SL1344的菌量。研究表明，外膜蛋白OmpX和OmpA在阪崎克羅諾桿菌黏附宿主的過程中起到了重要的作用[34]。Shi Chao等[18]研究表明，百里醌可降低編碼外膜蛋白OmpX和OmpA的基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而一定程度上抑制阪崎克羅諾桿菌對(duì)HT29細(xì)胞的黏附及侵入作用。在本研究中，硫辛酸可降低阪崎克羅諾桿菌侵襲宿主細(xì)胞的能力，從而在阪崎克羅諾桿菌引發(fā)宿主感染的最初環(huán)節(jié)降低阪崎克羅諾桿菌的感染能力。

阪崎克羅諾桿菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活及增殖，這種能力使其能夠逃避宿主的免疫應(yīng)答，并進(jìn)一步引發(fā)宿主更深層次的感染[35]。研究表明，阪崎克羅諾桿菌在被人巨噬細(xì)胞U937吞噬后能夠繼續(xù)在細(xì)胞中存活至96 h，其在巨噬細(xì)胞中復(fù)制和存活的能力使其得到了免疫系統(tǒng)的保護(hù)并有利于疾病的進(jìn)一步擴(kuò)散[36]。本研究結(jié)果表明，硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活量及增殖量（圖6）。前期研究表明，檸檬醛能夠顯著抑制阪崎克羅諾桿菌在巨噬細(xì)胞RAW 264.7內(nèi)的生存和復(fù)制能力[19]。類似地，Muyyarikkandy等[37]證明SIC的乳酸菌代謝產(chǎn)物可抑制腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌以及海德堡沙門氏菌在巨噬細(xì)胞中的存活能力。研究表明，阪崎克羅諾桿菌中的sod基因可編碼超氧化物歧化酶，以合成該酶與巨噬細(xì)胞中的活性氧發(fā)生中和反應(yīng)，從而抵抗巨噬細(xì)胞的殺菌作用[17]。因此硫辛酸是否是通過降低sod等相關(guān)基因的表達(dá)來降低其對(duì)抗宿主免疫反應(yīng)的能力，從而使其難以在體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)展，還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，硫辛酸在體外可抑制阪崎克羅諾桿菌的感染能力，有潛力作為膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于食品控制由阪崎克羅諾桿菌引起的相關(guān)感染。然而，當(dāng)硫辛酸作為膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用體內(nèi)抑制阪崎克羅諾桿菌的感染能力時(shí)，硫辛酸在體內(nèi)的代謝以及與食品中的一些營(yíng)養(yǎng)素的相互作用從而可能會(huì)影響到其在體內(nèi)對(duì)阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將繼續(xù)探究硫辛酸在體內(nèi)對(duì)阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用，進(jìn)一步為硫辛酸作為膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于食品中控制阪崎克羅諾桿菌的感染能力提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究探究了硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用。結(jié)果表明，硫辛酸對(duì)阪崎克羅諾桿菌具有一定的抑制效果，其對(duì)阪崎克羅諾桿菌的MIC為5.00 mg/mL；SIC的硫辛酸（30、60 μg/mL）可抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)及群集運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力；同時(shí)，SIC的硫辛酸可減弱阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力并降低其在巨噬細(xì)胞RAW264.7中存活及增殖的能力。本研究結(jié)果表明硫辛酸能夠減弱阪崎克羅諾桿菌的感染能力，這為硫辛酸作為膳食補(bǔ)充劑用于預(yù)防和控制由阪崎克羅諾桿菌引起的相關(guān)感染提供理論依據(jù)。