高通量測(cè)序分析白切雞菌群多樣性

宋相宇，李 鳴，王虎虎，徐幸蓮，蔡林林

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇高校肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

白切雞又叫白斬雞，屬于中國(guó)傳統(tǒng)醬鹵肉制品的一種，具有“爽滑彈嫩”的食用品質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛。為了最大限度地保持雞肉的新鮮口感和風(fēng)味，白切雞在加工過(guò)程中加熱溫度低、時(shí)間短，甚至很難達(dá)到巴氏殺菌的要求，因此白切雞成品極易腐敗變質(zhì)[1]。包裝方式及貯藏溫度對(duì)白切雞中的微生物生長(zhǎng)繁殖具有極大影響，因此，探明白切雞貯藏期間的菌群多樣性是控制細(xì)菌繁殖、延長(zhǎng)貨架期的基礎(chǔ)。

目前絕大多數(shù)研究主要集中于包裝方式及貯藏溫度對(duì)生鮮肉中微生物菌群結(jié)構(gòu)及貨架期的影響，結(jié)果表明不同氣調(diào)包裝方式結(jié)合低溫貯藏（0～4 ℃）能夠有效降低雞肉[2-3]、羊肉[4-5]、牛肉[6-7]中微生物菌落數(shù)，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。目前常用的菌相分析鑒定手段為微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分子生物技術(shù)相結(jié)合的方法[8-9]，但是這些方法自身存在很大的局限性，比如自然狀態(tài)下環(huán)境中的大部分微生物都無(wú)法通過(guò)分離培養(yǎng)而得到，因此經(jīng)過(guò)微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)方式分析得到的微生物菌相信息單調(diào)、不全面，而PCR-DGGE技術(shù)雖然相對(duì)前者對(duì)菌株的鑒定速度更快，但依舊受到結(jié)果信息不全面的制約[10]。高通量測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，以16S rDNA特定可變高通量測(cè)序最為典型，是近年研究菌群多樣性的新手段[11-12]。16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10 個(gè)保守區(qū)域和9 個(gè)高變區(qū)域（V1～V9），其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性[13]。對(duì)16S rDNA某個(gè)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，可用于食品微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性的快速分析，已成功應(yīng)用于豬肉[14]、雞肉[15-16]等生鮮肉品微生物菌群多樣性分析，而對(duì)于肉制品的研究較少?；诖耍緦?shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)醬鹵肉制品白切雞為研究對(duì)象，結(jié)合Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析不同包裝及貯藏溫度下白切雞菌群結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，為后期靶向抑制其腐敗及延長(zhǎng)貨架期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪山草母雞整雞胴體（日齡115 d，凈質(zhì)量約1 kg）購(gòu)于常州立華大型肉雞屠宰公司。

DNA提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司；DNA凝膠回收試劑盒 杭州AxyPrep公司；GelRed染料 美國(guó)Biotium公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SMART500氣調(diào)包裝機(jī) 西班牙ULMA公司；H P P 2 6 0 恒溫恒濕箱、I C P 2 6 0 生化培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmert公司；WH-2連續(xù)點(diǎn)動(dòng)微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；J2-MI高速冷凍離心機(jī)、Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckmen公司；9700型PCR儀美國(guó)ABI公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

白切雞制作工藝：原料生鮮雞→沸騰鹵水中浸提（3 次，2～3 s/次）→冰水沖洗→浸煮（95 ℃）→冰水冷浸→包裝→成品雞，將熟制后的白切雞樣品置于聚乙烯托盤中，采用空氣托盤（AP）、100% N2氣調(diào)（MN）和30% CO2+70% N2氣調(diào)（MC）3 種方式包裝，分別置于（4.0±0.1）℃（冷鮮溫度）、（12.0±0.1）℃（市場(chǎng)低溫貨柜實(shí)際溫度）下貯藏。取生鮮雞、新鮮白切雞（貯藏0 d）和各處理組在貯藏中期及末期時(shí)的樣品各3 盒測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，具體取樣時(shí)間及樣品編號(hào)見表1。

表 1 樣品處理方式及取樣時(shí)間Table 1 Sample processing methods and sampling times

1.3.2 菌體的收集

采用洗脫法[17]收集樣品中的微生物，并加以改進(jìn)。在無(wú)菌環(huán)境中打開樣品，迅速放入裝有約200 mL生理鹽水（氯化鈉質(zhì)量濃度0.85 g/100 mL）的均質(zhì)袋中，密封后雙手充分揉捏約10 min使雞肉捏碎、雞骨揉斷。隨后將均質(zhì)袋中的樣品-洗滌液混合物置于拍打式均質(zhì)機(jī)中，選擇第2力度（6 次/s）拍打30 s，進(jìn)行4 次，使樣品得到充分洗滌均質(zhì)。樣品-洗滌液混合物經(jīng)無(wú)菌濾紙簡(jiǎn)單過(guò)濾后，將濾液倒入無(wú)菌離心管中，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，取上清液于新離心管中在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，去除上清液，將沉淀富集并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總DNA的提取

采用DNA快速提取試劑盒按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行對(duì)所有樣品進(jìn)行DNA抽提，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

按指定測(cè)序區(qū)域（16S rDNA V3～V4區(qū)），合成帶有barcode的特異引物。每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。使用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，并進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。構(gòu)建Illumina PE250文庫(kù)后上機(jī)由上海靈恩生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.5 生物學(xué)信息分析

首先將利用Illumina PE250平臺(tái)測(cè)序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU可以進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。所得數(shù)據(jù)用Excel軟件和SAS V8.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用OriginPro 8軟件作圖，采用SPSS 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用EZinfo 3.0軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品Alpha多樣性分析結(jié)果

表 2 白切雞微生物菌群Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of microbial flora in soft-boiled chicken

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標(biāo)的Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)對(duì)樣品微生物物種豐富度和均勻度進(jìn)行評(píng)估[18]。群落豐富度用Chao1指數(shù)描述，其值越高表明群落物種的豐富度越高，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映樣品的群落多樣性程度，Shannon指數(shù)越高、Simpson指數(shù)越低，表明群落物種的多樣性越高。由表2可以看出，所有樣品的OTU覆蓋率（Coverage指數(shù)）都達(dá)99.9%以上，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所建立的文庫(kù)可以比較真實(shí)、有效地反映樣本微生物的多樣性。從所有樣本測(cè)序結(jié)果抽取的OTU數(shù)量中，最多的為195，最少的為105，樣品包裝處理后得到的OTU數(shù)量較正常組樣本減少，說(shuō)明包裝處理能有效降低樣本中的微生物種類。但所有樣本之間的細(xì)菌菌群多樣性較為相似，OTU數(shù)量相差不大。其中，正常組樣本Chao1指數(shù)均大于其他樣本，說(shuō)明正常組樣本的菌群豐度最高，而4 ℃-AP-2樣本的豐度最低；正常組樣本Shannon指數(shù)高于其他樣本，且Simpson指數(shù)低于其他樣本，說(shuō)明其菌群多樣性最高。Shannon-Wiener曲線[19]可以反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。本實(shí)驗(yàn)所有樣本的曲線都隨著橫坐標(biāo)的延長(zhǎng)而逐漸穩(wěn)定，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，所含菌種數(shù)較多。

2.2 Beta多樣性分析結(jié)果

圖 1 白切雞微生物菌群NMDS分析圖Fig. 1 NMDS analysis of microbial flora in soft-boiled chicken

Beta多樣性主要分析了樣本與樣本間微生物群落組成的相似性[20]。非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析法是評(píng)估Beta多樣性的方式之一，它以點(diǎn)的形式將樣本包含的物種信息反映在多維空間上，通過(guò)點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離體現(xiàn)樣本間的差異程度[21]。由圖1可以看出，每組內(nèi)各個(gè)樣品點(diǎn)分布區(qū)域比較密集，樣品個(gè)體差異性較小，每組內(nèi)3 個(gè)樣品微生物群落結(jié)構(gòu)相似，平行性較好。4 ℃下貯藏，除MN-2處理組中3 個(gè)點(diǎn)所形成的圓形面積略大，其余各組所形成的圓形面積小，說(shuō)明樣品平行性好。包裝方式與貯藏溫度變化時(shí)，各組圓圈交集較少，群落組成出現(xiàn)差距，此時(shí)不同處理發(fā)揮了作用，對(duì)白切雞菌群群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組區(qū)分明顯。

2.3 物種組成分析結(jié)果

2.3.1 基于門分類水平的分析結(jié)果

經(jīng)物種組成分析可得知一個(gè)或多個(gè)樣本在各分類水平上比對(duì)情況。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，能觀測(cè)樣本在門、綱、目、科、屬的群落結(jié)構(gòu)[18]。實(shí)驗(yàn)共得到2 216 類OTU，且這些OTU都屬于細(xì)菌域，包括5 個(gè)門、40 個(gè)屬，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)分析了門和屬水平。

由圖2 可知，各組樣本生成的OT U 主要由4 個(gè)門構(gòu)成：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria），其中變形菌門和厚壁菌門在42 個(gè)樣品中占主導(dǎo)地位。鮮肉組和正常組兩種優(yōu)勢(shì)菌門分別占細(xì)菌總序列的88.50%和92.00%，4 ℃下AP組、MN組和MC組的占比（所有時(shí)間的平均值，下同）分別為99.85%、98.65%和96.70%，12 ℃下3 個(gè)處理組的占比更達(dá)到了99.9%，所有組別在兩個(gè)溫度下的變形菌門和厚壁菌門豐度之和平均占96.93%，說(shuō)明包裝處理有效降低了白切雞中菌群的多樣性。此外，處理組樣本中嗜熱菌門（Thermophila）豐度極低，可能與貯藏溫度較低有關(guān)。

圖 2 白切雞微生物菌群門水平物種組成分析柱狀圖Fig. 2 Histogram obtained from microbial floral composition analysis of soft-boiled chicken at the phylum level

圖 3 白切雞微生物菌群屬水平物種組成分析柱狀圖Fig. 3 Histogram obtained from microbial floral composition analysis of soft-boiled chicken at the genus level

2.3.2 基于屬分類水平的分析結(jié)果

包裝方式及貯藏溫度對(duì)白切雞屬水平菌群組成的影響結(jié)果如圖3所示。為方便分析，選取豐度排名在前50的屬進(jìn)行聚類，以便發(fā)現(xiàn)部分物種在不同樣品中的聚集信息。由圖4可知，假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜冷菌屬（Psychrophila）和乳桿菌屬（Lactobacillus）等為鮮肉組中相對(duì)豐度較高的菌屬。AP組貯藏末期，尤其是4 ℃-AP-2處理組，樣品中的菌相較為單調(diào)，假單胞菌屬成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌，其與環(huán)絲菌屬（Brochothrix）等共同抑制了其他非優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)。而含30% CO2的氣調(diào)包裝處理組在貯藏末期的菌相對(duì)較復(fù)雜，假單胞菌屬不再是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌，造成CO2氣調(diào)包裝處理組樣品腐敗的主要優(yōu)勢(shì)菌屬包括環(huán)絲菌屬、沙雷菌屬（Serratia）和肉桿菌屬（Carnobacterium）等，同時(shí)嗜酸菌乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬的相對(duì)豐度也比托盤包裝處理組更高。

圖 4 白切雞微生物菌群屬水平熱圖Fig. 4 Heatmap obtained from microbial floral composition analysis of soft-boiled chicken at the genus level

包裝方式及貯藏溫度會(huì)影響白切雞菌群屬水平上的組成。原料雞和新鮮白切雞兩個(gè)處理組中樣品的微生物種類及相對(duì)豐度比較相似。所有托盤包裝中樣品的假單胞菌屬都是相對(duì)豐度最大的菌屬，尤其在4 ℃下貯藏時(shí)，12 ℃下AP組較4 ℃不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度更高。在MN及MC氣調(diào)包裝中，微生物的相對(duì)豐度則明顯與AP處理組不同，假單胞菌屬不再是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌屬，尤其在MC處理組，假單胞菌屬的相對(duì)豐度在貯藏末期不足10%。此外，在MC及MN氣調(diào)包裝中，環(huán)絲菌屬及沙雷菌屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，12 ℃條件同4 ℃條件相比，前者中腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）相對(duì)豐度約為15%，而后者中腸桿菌屬也是其低豐度優(yōu)勢(shì)菌群之一，12 ℃下MC及MN處理組中優(yōu)勢(shì)腐敗菌還包括克呂沃爾菌屬（Kluyvera），而4 ℃條件下該包裝樣品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為肉桿菌屬，說(shuō)明貯藏溫度同樣顯著影響著貯藏末期白切雞中的微生物組成。

2.4 物種主坐標(biāo)分析結(jié)果

圖 5 不同包裝及貯藏條件下白切雞的微生物群落結(jié)構(gòu)比較Fig. 5 Comparison of microbial community structures of soft-boiled chicken under different packaging and storage conditions

主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，用來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性[22]。圖中點(diǎn)的距離越近表示菌群結(jié)構(gòu)越相似。由圖5可知，PC1為46.86%，PC2為32.46%，PC1與PC2的綜合差異能夠解釋全部結(jié)果的81.00%，可以用來(lái)解釋組間差異。從圖5可以看出，同一處理組不同平行的點(diǎn)比較聚集，說(shuō)明樣品測(cè)序結(jié)果的重復(fù)性較好。鮮肉組及正常組無(wú)論是在PC1還是PC2上的投影都能夠同其他處理組顯著區(qū)分開。此外，不同包裝、不同貯藏溫度樣品在貯藏中期及末期所含物種的主成分逐漸分開，在不同象限聚集，說(shuō)明不同處理組樣品的菌群結(jié)構(gòu)隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸表現(xiàn)出差異。AP組的樣品在PC1上能同絕大多數(shù)氣調(diào)包裝的樣品顯著區(qū)分，并且在4 ℃貯藏中期及末期樣品重復(fù)的間聚集性很高，表明該兩組樣品中出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)菌群，并且抑制了其他菌的生長(zhǎng)。MN和MC氣調(diào)包裝的樣品在不同溫度下貯藏中期及末期的菌種差異同樣主要體現(xiàn)在PC1上，但同一氣調(diào)包裝不同處理、不同階段間的物種變化趨勢(shì)無(wú)明顯規(guī)律。

3 討 論

微生物是影響白切雞品質(zhì)和食用安全性的主要因素，而包裝方式和貯藏溫度對(duì)微生物的種類及數(shù)量有極大影響。因此，通過(guò)分析不同包裝及貯藏溫度下白切雞的菌群結(jié)構(gòu)，從而為企業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)者提供指導(dǎo)是非常有必要的。

不同處理組菌群之間差異較大，尤其在屬水平上。原料生鮮雞以及新鮮白切雞處理組中樣品的微生物種類和相對(duì)豐度比較相似，可見白切雞中的微生物主要來(lái)源于原料雞，并且加工工藝限制、原料雞清洗不完善等原因，使得白切雞所含微生物的種類十分繁雜[23]。12 ℃ AP組中不動(dòng)桿菌屬豐度較4 ℃處理組高，不動(dòng)桿菌屬是嚴(yán)格的需氧非發(fā)酵革蘭氏陰性球菌[24]，黏附性極強(qiáng)，是雞胴體天然攜帶的微生物。Carvalheira等[25]從超市購(gòu)買的雞肉中提取出不動(dòng)桿菌，并對(duì)其流行情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌并非嗜冷菌，因此可能在12 ℃下更有利于不動(dòng)桿菌屬的生長(zhǎng)。而在MN及MC氣調(diào)包裝中，假單胞菌屬不再是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌屬，尤其是MC處理組。假單胞菌是有氧貯存和氣調(diào)包裝冷鮮肉中常見的腐敗微生物[26-27]，其含有復(fù)雜豐富的酶系統(tǒng)比如蛋白分解酶和耐熱酶，所以其適應(yīng)性和致腐能力較強(qiáng)，即使在低溫條件下也能生長(zhǎng)繁殖。Andreani等[28]報(bào)道有氧環(huán)境和富含蛋白的食品能加速假單胞菌屬的生長(zhǎng)繁殖，從而加速食品的腐敗，同時(shí)，在禽肉及加工肉制品中假單胞菌屬主要包括草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）、隆德假單胞菌（Pseudomonas lundensis）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）3 種，其中草莓假單胞菌從肉中分離出的比例最高，為56.7%～79.0%[29]。還有研究表明，無(wú)氧環(huán)境中較高的CO2濃度在8 ℃幾乎完全抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)[30]。因此，MC氣調(diào)包裝中，在缺氧和CO2抑菌作用的雙重作用下，假單胞菌屬的生長(zhǎng)繁殖得到了很好的抑制。在MC氣調(diào)包裝中，環(huán)絲菌屬及沙雷菌屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，有研究報(bào)道，沙雷菌屬及環(huán)絲菌屬不論在有氧還是無(wú)氧條件下都能夠生長(zhǎng)繁殖[31-33]，無(wú)氧包裝對(duì)其抑制效果不為明顯，其中熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）也是原料肉中主要的一種污染菌，具有很強(qiáng)分解蛋白和脂肪的能力[34]，在豬肉、牛肉、羊肉及腌制肉中均存在[35]。周富裕[36]研究表明，環(huán)絲菌屬是氣調(diào)包裝醬鹵肉制品中的主要腐敗菌之一，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。12 ℃下MC處理組中優(yōu)勢(shì)腐敗菌還包括腸桿菌屬和克呂沃爾菌屬，唐雪婷等[37]研究表明，低溫對(duì)接種的腸桿菌科生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

4 ℃下MC氣調(diào)包裝末期處理組樣品腐敗的優(yōu)勢(shì)菌屬還包括肉桿菌屬，該菌屬能夠分解糖類產(chǎn)生乳酸，降低環(huán)境pH值，使得乳球菌屬和乳桿菌屬的相對(duì)豐度也較托盤包裝處理組更高。乳球菌屬和乳桿菌屬具有較強(qiáng)的耐酸能力[38]，大部分的乳球菌和乳桿菌在缺氧的環(huán)境下能夠生長(zhǎng)繁殖，而在托盤包裝中可能會(huì)因受到其他菌群的制約無(wú)法大量繁殖，因此乳球菌屬和乳桿菌屬往往也會(huì)成為缺氧條件下禽肉制品的一種優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

4 結(jié) 論

采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析了包裝方式及貯藏溫度對(duì)白切雞中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)不同處理對(duì)樣品的微生物多樣性產(chǎn)生了較大影響。托盤包裝中，不論在12 ℃還是4 ℃下優(yōu)勢(shì)菌屬均為假單胞菌屬；MC處理組4 ℃貯藏末期優(yōu)勢(shì)菌屬包括肉桿菌屬，表明低溫貯藏的白切雞存在一定的致病風(fēng)險(xiǎn)；MC包裝在4 ℃下貯藏能夠有效減少白切雞微生物菌群的多樣性。