不明原因發(fā)熱患者肺泡灌洗液病毒群落解析

李欣霖，劉齊，陳旭，肖宇晴，楊世興，張文，陳建國

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

不明原因發(fā)熱是指持續(xù)發(fā)熱3周以上，多次測得體溫超過38℃，入院檢查1周仍然沒有明確原因的發(fā)熱[1]。不明原因發(fā)熱病因復(fù)雜多樣，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，同時(shí)容易受到治療藥物的影響，通過常規(guī)的檢測手段很難確診。能夠?qū)е虏幻髟虬l(fā)熱的病因多達(dá)200多種，主要包括感染性疾病、結(jié)締組織病、腫瘤性疾病等，其中以感染性疾病為主，而肺部感染又占有較大比例[2]。病毒作為肺部感染的重要病原體之一，是引起發(fā)熱的重要原因[3]。目前對(duì)于病毒的檢測，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法發(fā)揮了重要的作用，但病毒分離培養(yǎng)效率較慢，分子生物學(xué)方法例如PCR技術(shù)只能檢測出已知序列的病毒，對(duì)于新型病毒的檢測具有較大局限性，而病毒宏基因組學(xué)利用高通量測序技術(shù)可以對(duì)樣本中幾乎所有核酸序列進(jìn)行測定，不僅可以分析樣品中病毒群落組成，還能夠監(jiān)測某些致病性病毒的變化情況，并能提前發(fā)現(xiàn)潛在的新型致病性病原體。本研究采用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)不明原因發(fā)熱患者肺泡灌洗液中的病毒群落進(jìn)行初步解析，探討肺部病毒群落與不明原因發(fā)熱之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 肺泡灌洗液樣本的采集

收集2018年6月至2019年4月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院診治的不明原因發(fā)熱患者(平均年齡67歲)肺泡灌洗液樣本共80份，其中58份樣本用于文庫構(gòu)建，文庫構(gòu)建后繼續(xù)收集22份肺泡灌洗液用于陽性樣本篩選，并采集40份健康者咽拭子作為陰性對(duì)照。均使用一次性無菌用具采集后于-20 ℃冷凍運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。用1.5 mL無RNA酶的EP管從每份樣本中吸取1 mL肺泡灌洗液，于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒宏基因組文庫構(gòu)建及深度測序

1.2.1 高通量文庫的構(gòu)建[4-5]樣本處理：從-80 ℃冰箱中取出樣本置于冰上備用，振蕩15 min，12 000×g離心10 min，吸取上清液200 μL至另一新1.5 mL無RNA酶 EP管中，保存待用。將58個(gè)樣本共分為5個(gè)文庫，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)文庫分別由12個(gè)樣本組成，各樣本吸取41.7 μL混合制備成500 μL體系；4號(hào)、5號(hào)文庫分別由11個(gè)樣本組成，各樣本吸取45.5 μL混合制備成500 μL體系。過膜除去微小顆粒物質(zhì)。利用核酸消化酶(美國Life Technologic公司)去除各文庫中無蛋白衣殼保護(hù)的游離核酸，使用MiniBEST 病毒核酸提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取樣本中的病毒核酸，采用SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologic公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將文庫中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用Klenow酶(美國New England Biolabs公司)將單鏈DNA合成雙鏈DNA，用于文庫的構(gòu)建。高通量測序文庫的構(gòu)建采用Nextera XT DNA 樣品制備試劑盒(美國Illumina公司)。

1.2.2 文庫的擴(kuò)增、純化與測序 利用二代測序接頭引物試劑盒(美國Illumina公司)將合成后的DNA加上接頭后進(jìn)行擴(kuò)增，接著采用QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒(德國Qiagen公司)對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并采用Agencourt AMPure XP文庫篩選試劑盒(美國Beckman公司)除去文庫中小的DNA片段和引物二聚體，從而獲得長度在300～800 bp的DNA文庫，送至上海生工生物有限公司Illumina Miseq測序平臺(tái)進(jìn)行深度測序。

1.2.3 文庫測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析 通過Miseq平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測序并對(duì)測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測，保留質(zhì)檢合格的測序數(shù)據(jù)后借助Vendor軟件將原始數(shù)據(jù)輸出，利用Bowite 2軟件除去原始數(shù)據(jù)中的真核及原核基因組序列后，再利用VecScreen軟件剪切掉序列兩端的引物和接頭，將所得序列進(jìn)行拼接，之后放入病毒蛋白組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast X搜索，最后將核酸序列按照病毒分類，以網(wǎng)頁的形式輸出。

1.3 病毒基因組擴(kuò)增及陽性樣本篩選

1.3.1 肺泡灌洗液中病毒核酸的提取 陽性樣本篩選包括用于文庫構(gòu)建的58份肺泡灌洗液及22份后期采集的灌洗液共80份，使用MiniBEST病毒核酸提取試劑盒提取病毒核酸。

1.3.2 PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增測序 用Geneious 11軟件設(shè)計(jì)細(xì)環(huán)病毒及鼻病毒巢式引物，引物序列見表1。細(xì)環(huán)病毒 PCR外套反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共循環(huán)31次，擴(kuò)增結(jié)束后72 ℃延伸5 min。內(nèi)套反應(yīng)退火溫度為55℃，其余條件同外套反應(yīng)。

鼻病毒PCR外套反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)35次，擴(kuò)增結(jié)束后72 ℃延伸10 min。內(nèi)套反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)25次，擴(kuò)增結(jié)束后72 ℃延伸10 min。

細(xì)環(huán)病毒和鼻病毒擴(kuò)增均選用TaKaRa公司r-Taq酶體系，外套：r-Taq酶10 μL，DEPC水 8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，樣本 1 μL，共計(jì)20 μL體系。內(nèi)套：r-Taq酶25 μL，DEPC水 22 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，樣本1 μL，共計(jì)50 μL體系。最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)各陽性樣本，采用MiniBEST瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)對(duì)切下的目的片段進(jìn)行膠回收，并送Illumina MiSeq測序平臺(tái)測序。

表1 巢式PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液文庫中病毒群落組成

高通量測序后的最終結(jié)果通過網(wǎng)頁的形式輸出，可以看到各個(gè)文庫中包含的各種病毒，包括各個(gè)病毒的科、屬、種以及每種病毒序列的最大重疊群堿基長度和序列條數(shù)。通過統(tǒng)計(jì)后可以得到各個(gè)文庫中的病毒群落組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號(hào)文庫的病毒種類及所包含的病毒序列明顯少于其余文庫，同時(shí)在5個(gè)文庫中都存在的有圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Humanendogenousretrovirus,HERV)、藻去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、未分類病毒科(None)，而指環(huán)病毒科(Anelloviridae)、擬菌病毒科(Mimiviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)同時(shí)出現(xiàn)于多個(gè)文庫中。指環(huán)病毒科存在于第2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)文庫中，占有較大的比列，在2號(hào)、4號(hào)文庫中的序列數(shù)分別為1 249條和753條，明顯高于其他文庫，且在4號(hào)文庫中存在的最大重疊序列(Contig)長達(dá)2 199 bp。小RNA病毒科(Picornaviridae)僅存在于1號(hào)與4號(hào)文庫中，并且序列數(shù)低，分別為2條和3條。

將各病毒科的序列條數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后對(duì)各文庫病毒群落進(jìn)行比較(表2)，與指環(huán)病毒科相關(guān)的序列數(shù)共2 207條(占總體45.0%)，圓環(huán)病毒科65條(1.3%)，藻去氧核糖核酸病毒科91條(1.9%)，人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科68條(1.4%)，逆轉(zhuǎn)錄病毒科14條(0.3%)，痘病毒科1 376條(28.1%)，帚狀病毒科660條(13.5%)，未分類病毒科336條(6.9%)，小RNA病毒科5條(0.1%)，其他病毒科78條(1.6%)。

將5個(gè)文庫中的病毒群落組成統(tǒng)計(jì)整理后并以餅狀圖展示(圖1)，可以直觀看出各個(gè)文庫中每個(gè)病毒所占比例，同時(shí)整理后得到5個(gè)肺泡灌洗液文庫中總體病毒群落組成：指環(huán)病毒科占19.4%，圓環(huán)病毒科占11.0%，藻去氧核糖核酸病毒科占11.0%，人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科占10.2%，痘病毒科占4.9%，逆轉(zhuǎn)錄病毒科占3.2%，帚狀病毒科(Virgaviridae)占2.3%，小RNA病毒科占0.6%，未分類病毒科占24.7%，虹彩病毒科、擬菌病毒科等其他病毒科共占12.7%。

表2 肺泡灌洗液文庫內(nèi)病毒相關(guān)序列數(shù)比較

A：1號(hào)文庫；B：2號(hào)文庫；C：3號(hào)文庫；D：4號(hào)文庫；E：5號(hào)文庫；F：1～5號(hào)文庫總體病毒群落組成

2.2 細(xì)環(huán)病毒陽性樣本篩選結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化分析

指環(huán)病毒科在肺泡灌洗液病毒群落中所占比例最大，其中與細(xì)環(huán)病毒相關(guān)序列數(shù)最多，通過拼接延長后獲得的最大重疊序列為2 199 bp，故以該序列為模板設(shè)計(jì)PCR引物，在所有樣本中進(jìn)行細(xì)環(huán)病毒陽性樣本的篩選，電泳結(jié)果見圖2，其中陽性條帶位于370 bp左右的位置，共有9份陽性樣本，分別為26號(hào)、37號(hào)、38號(hào)、41號(hào)、46號(hào)、47號(hào)、72號(hào)、75號(hào)、76號(hào)。將陽性樣本切膠純化后測序，通過Blast N比對(duì)后均屬于細(xì)環(huán)病毒，陽性率為11.3%。而陰性對(duì)照中共篩選出細(xì)環(huán)病毒陽性樣本2份，陽性率為5.0%。

將各個(gè)文庫指環(huán)病毒科中序列條數(shù)較多的病毒通過拼接延長之后，共獲得4個(gè)細(xì)環(huán)病毒的開放閱讀框1(ORF1)氨基酸序列，分別表示為HTTVL1(MN893308)、HTTVL2(MN893309)、HTTVL3(MN893310)，它們分別存在于2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)文庫中；HTTVL4(MN893311)為4號(hào)文庫中的細(xì)環(huán)病毒13型(torque teno virus 13)，根據(jù)他們的ORF1氨基酸序列構(gòu)建而成的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。從發(fā)育樹上可以看出，HTTVL1與來自美國肝炎患者的細(xì)

A：1～20號(hào)樣本；B：21～40號(hào)樣本；C：41～60號(hào)樣本；D：61～80號(hào)樣本。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物

環(huán)病毒(AB017610)聚集，同源性為90.2%；HTTVL2與來自美國艾滋病患者血漿的細(xì)環(huán)病毒(ANQ39345)聚集，同源性為89.3%；HTTVL3與屬于未分類指環(huán)病毒中的細(xì)環(huán)病毒(AHN50432)聚集，且同源性為93.3%；HTTVL4與屬于甲型細(xì)環(huán)病毒屬(Alphatorquevirus)的細(xì)環(huán)病毒13型(YP009505717)聚集，同源性為86.1%。

圖3 基于細(xì)環(huán)病毒開放閱讀框1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 鼻病毒陽性樣本篩選結(jié)果

鼻病毒屬于小RNA科病毒，雖然僅在1號(hào)、4號(hào)文庫中存在，但鼻病毒是重要的呼吸道病毒。為了進(jìn)一步研究其與發(fā)熱的關(guān)系，根據(jù)鼻病毒VP4/VP2區(qū)域核苷酸序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物進(jìn)行鼻病毒陽性樣本的篩選。電泳結(jié)果如圖4，共有8份陽性樣本，分別為41號(hào)、44號(hào)、46號(hào)、60號(hào)、70號(hào)、78號(hào)、79號(hào)、80號(hào)。將各陽性樣本純化后測序，再通過Blast N比對(duì)后得到41、44、60號(hào)屬于鼻病毒B型(rhinovirus B)，46、70、78、79號(hào)屬于鼻病毒A型(rhinovirus A)，80號(hào)未得到測序結(jié)果。

3 討論

病毒宏基因組學(xué)就是將樣品中所有的病毒與非病毒微生物分離后提取病毒核酸，運(yùn)用高通量測序技術(shù)進(jìn)行深度測序，然后將測序所得結(jié)果同數(shù)據(jù)庫中病毒序列進(jìn)行比對(duì)，并利用相關(guān)軟件處理后得到研究樣本中的病毒群落組成[6]。病毒宏基因組學(xué)技術(shù)避開了傳統(tǒng)方法難以檢測到變異度高的新型病毒的局限性，不僅可以分析各種環(huán)境中病毒群落的組成，還能夠發(fā)現(xiàn)潛在新型病毒，為人類發(fā)掘新型病毒及診斷各種病毒性疾病提供了方法和技術(shù)支持。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物

指環(huán)病毒科病毒是一種無包膜、環(huán)狀、單鏈DNA病毒，基因組長度為2.1～3.9 kb[7]，基因組GC含量較高，一般含有3～4個(gè)開放閱讀框，可細(xì)分為細(xì)環(huán)病毒(TTV)，小細(xì)環(huán)病毒(torque teno mini virus, TTMV)，中細(xì)環(huán)病毒(torque teno midi virus, TTMDV)等[8-9]。指環(huán)病毒可以在許多不同宿主中被檢測到，包括人類、家畜、家禽等，雖然指環(huán)病毒在人類和動(dòng)物中廣泛流行并被懷疑與某些人類或動(dòng)物的疾病相關(guān)，具有較高的遺傳多樣性，但其病原學(xué)作用尚未明確[10-12]。在指環(huán)病毒家族中，細(xì)環(huán)病毒和中細(xì)環(huán)病毒被認(rèn)為與發(fā)熱有關(guān)[13]。本研究通過對(duì)所構(gòu)建的5個(gè)肺泡灌洗液文庫進(jìn)行深度測序，結(jié)果在各個(gè)文庫中均未檢測到常見的呼吸道病毒，例如呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、流感病毒等，而且1號(hào)文庫病毒種類明顯少于其他4個(gè)文庫。這可能與文庫中相應(yīng)的病毒滴度過低，或者文庫構(gòu)建不佳有關(guān)。文庫構(gòu)建過程中的過濾及核酸的消化對(duì)DNA產(chǎn)量有著較大的影響，而增加測序深度可以在一定程度上減少文庫對(duì)最終結(jié)果的影響。從病毒群落組成上看，除去未分類科病毒，文庫中的病毒群落以指環(huán)病毒科病毒為主體，占整體文庫的19.4%，其次為圓環(huán)病毒科、藻去氧核糖核酸病毒科、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科、痘病毒科等。從各病毒序列數(shù)上看，指環(huán)病毒科序列數(shù)量在4個(gè)文庫中較高，占總體序列數(shù)的45.0%；痘病毒科存在于所有文庫中，是除指環(huán)病毒科之外序列數(shù)最多的病毒；5號(hào)文庫中帚狀病毒科序列數(shù)最多，為659條，2號(hào)文庫中僅有1條，其他3個(gè)文庫為0；小RNA病毒科僅存在于1號(hào)和4號(hào)文庫，并且序列數(shù)很少。

綜合分析后發(fā)現(xiàn)：指環(huán)病毒科病毒占總體文庫的19.4%，同時(shí)存在于4個(gè)文庫中，分布廣泛。從病毒種類來看，樣本中指環(huán)病毒所占比例明顯高于其他病毒科，從高通量測序結(jié)果上看，共產(chǎn)生了2 207條與指環(huán)病毒科有關(guān)的序列，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他病毒科，并且通過拼接組裝產(chǎn)生了4條較長的序列，具有進(jìn)一步分析研究的意義。文庫中痘病毒科病毒主要是牛痘病毒及猴痘病毒，分布于所有文庫中并且具有較多的序列數(shù)量。痘病毒可以通過接觸或呼吸道傳播，感染后可能出現(xiàn)發(fā)熱的癥狀，但是常伴有典型的皮膚癥狀[14]，易于鑒別診斷。本研究中痘病毒序列數(shù)量較多，但是拼接后產(chǎn)生的最大重疊序列僅有200～300 bp，通過Blast X比對(duì)后均未產(chǎn)生有意義的結(jié)果。帚狀病毒科病毒作為植物病毒，與其相關(guān)的序列數(shù)雖然較多，但是集中在5號(hào)文庫中，考慮可能是由實(shí)驗(yàn)過程中的污染造成的。雖然圓環(huán)病毒科、藻去氧核糖核酸病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科也占有一定比例，但是與它們相關(guān)的序列數(shù)少，樣本中病毒滴度低，同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒普遍存在于人類基因組中，一般情況下無致病性，所以認(rèn)為這些病毒與不明原因發(fā)熱的相關(guān)性并不高。小RNA病毒僅存在于1號(hào)和4號(hào)文庫中，只占病毒總體的0.6%，并且其序列數(shù)較少，但小RNA病毒是病毒性肺炎的常見病原體之一[15]，為了探究其與疾病之間的關(guān)系，故同樣對(duì)其進(jìn)行陽性樣本篩選及分析。

本研究對(duì)5個(gè)肺泡灌洗液文庫進(jìn)行測序，結(jié)果表明指環(huán)病毒在2、3、4、5號(hào)文庫中所占比例較高，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析后通過Blast N比對(duì)后確定指環(huán)病毒科中以細(xì)環(huán)病毒為主，并且與其相關(guān)的序列數(shù)量及最大重疊序列均明顯高于其他病毒科。對(duì)用于文庫構(gòu)建的58份樣本進(jìn)行陽性篩選后，共發(fā)現(xiàn)6份細(xì)環(huán)病毒陽性樣本(10.3%)，后期采集的22份肺泡灌洗液樣本中篩選出陽性樣本3份(13.6%)。雖然不同時(shí)間段感染的病毒群落可能不完全相同，但后期收集的樣本僅用于流行病學(xué)分析，并且兩次取樣的陽性率是相似的,所以計(jì)算后80份樣本中細(xì)環(huán)病毒的陽性率為11.3%。因健康者肺泡灌洗液樣本較難獲取，而咽拭子中微生物種類與肺泡灌洗液相似[16]，故選取健康者咽拭子作為陰性對(duì)照，在40份咽拭子樣本中共有2份陽性，陽性率明顯低于肺泡灌洗液中細(xì)環(huán)病毒陽性率。既往有文獻(xiàn)對(duì)瑞士71例不明原因感染的肺移植患者的肺泡灌洗液及血液進(jìn)行病毒宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在患者血液和肺泡灌洗液中同時(shí)存在大量的細(xì)環(huán)病毒，并且病毒載量隨著患者免疫功能的下降而增多[17]。McElvania TeKippe等[13]報(bào)道在發(fā)熱兒童的血液中檢測到細(xì)環(huán)病毒，并且隨著體溫的升高細(xì)環(huán)病毒的檢出率也會(huì)隨之升高。對(duì)比既往相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)不論在血液或者是肺泡灌洗液中，細(xì)環(huán)病毒是一種容易被檢測到的病毒，并且病毒的載量會(huì)隨著患者發(fā)熱程度或是免疫情況的改變而發(fā)生變化。在本研究中細(xì)環(huán)病毒在不明原因發(fā)熱患者中的陽性率(11.3%)高于陰性對(duì)照中的陽性率(5.0%)，同時(shí)結(jié)合測序的結(jié)果，認(rèn)為不明原因的發(fā)熱與細(xì)環(huán)病毒存在一定的聯(lián)系。雖然細(xì)環(huán)病毒可以導(dǎo)致呼吸道疾病[18]，但并不認(rèn)為是由于細(xì)環(huán)病毒感染呼吸道而引起的發(fā)熱，可能是發(fā)熱在一定程度上為細(xì)環(huán)病毒的復(fù)制提供了一個(gè)良好的環(huán)境。同時(shí)患者多為高齡人群，免疫系統(tǒng)功能減弱及炎癥環(huán)境均可以促進(jìn)細(xì)環(huán)病毒的感染、增殖[17,19]。據(jù)報(bào)道細(xì)環(huán)病毒可以作為免疫功能低下的標(biāo)志[20]，但細(xì)環(huán)病毒感染是否可以導(dǎo)致肺炎及其致病性還有待研究。因指環(huán)病毒序列差異很大，所以基于指環(huán)病毒全基因組來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是困難的[5]。指環(huán)病毒主要包含ORF1和ORF2，ORF1主要負(fù)責(zé)編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)，ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap)[21]。為了確定文庫中所測得的細(xì)環(huán)病毒序列與其他指環(huán)病毒的關(guān)系，我們根據(jù)ORF1氨基酸序列，在基因庫中進(jìn)行Blast N比對(duì)得到具有代表性的指環(huán)病毒，一同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。分析后發(fā)現(xiàn)本研究中檢測到的4株細(xì)環(huán)病毒均屬于同一進(jìn)化分支，HTTVL1與細(xì)環(huán)病毒(AB017610)聚集，HTTVL2與細(xì)環(huán)病毒(ANQ39345)聚集，而HTTVL3的ORF1與細(xì)環(huán)病毒(AHN50432)的同源性最高，為93.3%，HTTVL4與細(xì)環(huán)病毒13型(YP009505717)聚集，它們分別來源于肝炎患者及艾滋病患者的血漿，并且測序所得的序列與基因庫中已知病毒序列的同源性皆為90.0%左右，可以看出它們與來自人類血漿的細(xì)環(huán)病毒高度同源。

小RNA病毒科是一種單股正鏈RNA病毒，其RNA本身就具有感染性[22]，是病毒性肺炎的常見病原體之一。該病毒科主要包括4個(gè)病毒屬：鼻病毒屬(rhinovirus)、腸道病毒屬(enterovirus)、心病毒屬(cardiovirus)和口瘡病毒屬(aphthovirus)[23]。本研究中鼻病毒僅存在于1號(hào)及4號(hào)文庫中，在所有樣本中陽性率為10%，但是文庫中病毒滴度很低，僅有5個(gè)序列，故考慮鼻病毒與不明原因發(fā)熱相關(guān)性不高。

綜上所述，本次研究利用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)不明原因發(fā)熱患者肺泡灌洗液樣本中的病毒群落進(jìn)行了解析，病毒群落中指環(huán)病毒科占比最高，其中細(xì)環(huán)病毒與不明原因發(fā)熱存在一定關(guān)系。研究結(jié)果為不明原因發(fā)熱患者的診斷治療及進(jìn)一步相關(guān)研究提供了依據(jù)。