不同CD8+T細(xì)胞分化狀態(tài)對(duì)CAR-T實(shí)體腫瘤療效影響的研究進(jìn)展

田圩虹，呂巧怡，劉雪，趙楊靜,2，王薈,2，邵啟祥,2

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

腫瘤免疫療法的革命性勝利將人們對(duì)各種免疫細(xì)胞及免疫分子的認(rèn)識(shí)推上了新的高度。榮獲2018年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法揭示了負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子細(xì)胞程序性死亡受體1(PD-1)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)在腫瘤治療中的重要作用。與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法在臨床獲得巨大成功一樣，嵌合型抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)療法也在臨床取得了驚人的療效。這種過繼性免疫增強(qiáng)化療法通過基因編輯的患者T細(xì)胞直接靶向抗原特異性腫瘤細(xì)胞，目前主要應(yīng)用于B細(xì)胞系急性白血病和淋巴瘤的治療。CTL019也因治療CD19+淋巴瘤獲得很高的臨床緩解率而成為CAR-T療法的典型代表[1]。

截至目前，關(guān)于CAR-T細(xì)胞在惡性血液系統(tǒng)腫瘤，乃至實(shí)體腫瘤上的研究如火如荼。相較于血液系統(tǒng)腫瘤的治療，CAR-T在實(shí)體腫瘤應(yīng)用方面面臨著許多挑戰(zhàn)。實(shí)體腫瘤抗原表型異質(zhì)性大，纖維膠原包裹致密，腫瘤微環(huán)境更為復(fù)雜，因此，在CAR-T治療中通常選用嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾的CD8+T細(xì)胞作為特異性細(xì)胞毒作用的主力群體。通過CAR修飾的CD8+T細(xì)胞識(shí)別抗原的方式類似于B細(xì)胞，不需要抗原提呈過程，且不受自身主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC) 限制，在活化后可快速攻擊殺傷腫瘤細(xì)胞。然而CD8+CAR-T用于實(shí)體瘤治療時(shí)出現(xiàn)體內(nèi)耗竭過度現(xiàn)象，細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，且效率較差。

研究表明處于分化終末期的成熟CD8+T細(xì)胞在過繼輸注后，在體內(nèi)除了出現(xiàn)復(fù)制性衰老和過早凋亡現(xiàn)象外，在淋巴歸巢循環(huán)、共刺激能力以及穩(wěn)態(tài)細(xì)胞因子釋放與獲取方面都明顯減弱[2]。而基于這些細(xì)胞構(gòu)建的CD8+CAR-T卻在體外具有顯著的細(xì)胞毒效應(yīng)，因此，體外的細(xì)胞毒作用效果并不能很好地反映其在體內(nèi)的腫瘤殺傷能力，這是目前CD8+CAR-T實(shí)體瘤治療亟待研究的重要問題。

1 CD8+CAR-T的制備與治療實(shí)體腫瘤的現(xiàn)狀

1.1 CD8+CAR-T的制備

CAR-T生產(chǎn)中T細(xì)胞群體的選擇和質(zhì)量控制對(duì)CAR-T過繼免疫療效起著決定性作用[3]。根據(jù)迄今為止完成的多項(xiàng)CAR-T臨床研究，不同CAR-T研究中選擇的T細(xì)胞亞群都存在顯著差異，但直接關(guān)于不同CAR-T產(chǎn)品的橫向?qū)Ρ妊芯旷r見報(bào)道。絕大多數(shù)針對(duì)腫瘤臨床治療的CAR-T不選擇絕對(duì)單一化T細(xì)胞亞群作為CAR修飾T細(xì)胞的來源，而是通過分離患者來源的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)或CD8+腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)來進(jìn)行體外擴(kuò)增誘導(dǎo)，再經(jīng)基因編輯后使用[4]。部分研究性實(shí)驗(yàn)選用分離自小鼠脾臟來源的淋巴細(xì)胞，經(jīng)CD3/CD28抗體、IL-2及IL-7誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖分化，以此制備相關(guān)CAR-T細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)研究抗腫瘤作用。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體進(jìn)行免疫防御與監(jiān)視的主要細(xì)胞，具有識(shí)別并殺傷惡性腫瘤和癌前病變細(xì)胞的能力。分離并采用患者自體來源的CD8+T細(xì)胞在乳腺癌、肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤等癌癥的CAR-T治療中已有大量報(bào)道，是目前最常用制備CD8+CAR-T的T細(xì)胞群體[5]。

體外基因編輯的CD8+CAR-T表達(dá)腫瘤特異性CAR和T細(xì)胞受體，經(jīng)過大量擴(kuò)增活化后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進(jìn)行免疫治療。CAR是靶向特定腫瘤抗原的重組受體，也是CAR-T細(xì)胞行使抗腫瘤殺傷作用的關(guān)鍵分子，其設(shè)計(jì)包含4個(gè)組分： ① 針對(duì)靶抗原的特異性單克隆抗體單鏈可變區(qū)(scFv)；② 跨膜區(qū)；③ 胞內(nèi)共刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域(CD27、CD28、4-1BB、OX40等)；④ T細(xì)胞受體活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(CD3ζ等)。到目前為止，CAR已有三代。第一代CAR包括單鏈抗體、跨膜區(qū)和CD3ζ胞內(nèi)區(qū)，但不包含共刺激信號(hào)活化轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；二代CAR在一代的基礎(chǔ)上加入了一個(gè)共刺激信號(hào)活化轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；三代CAR改善了共刺激分子，采用了雙共刺激信號(hào)活化轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合(比如CD28聯(lián)合4-1BB或OX40等)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)T細(xì)胞活化和增殖能力的優(yōu)化。目前在臨床使用的CAR-T以二代CAR為主體。在三代CAR之后，CAR-T制備更加注重體內(nèi)T細(xì)胞功能的優(yōu)化，比如在CAR-T細(xì)胞中共表達(dá)各類細(xì)胞因子或功能分子來增強(qiáng)CAR-T在體內(nèi)的增殖存活能力、細(xì)胞毒作用或拮抗腫瘤微環(huán)境的能力，如使用IL-7、IL-12、CCL19、TGF-β抗體、PD-1抗體等進(jìn)行共表達(dá)，有人也把這類CAR-T稱為第四代CAR-T。因此，與傳統(tǒng)的放化療相比較，CD8+CAR-T細(xì)胞療法具有更高的特異性、潛在的長(zhǎng)期保護(hù)效應(yīng)及更低的細(xì)胞毒性。

1.2 CD8+CAR-T的實(shí)體腫瘤治療現(xiàn)狀

根據(jù)賓夕法尼亞大學(xué)June教授2018年報(bào)告的全美1 000多例臨床CAR-T治療案例分析[6]，CAR-T療法針對(duì)成人急性B淋巴細(xì)胞白血病的初期緩解率高達(dá)93%。針對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病，大B細(xì)胞淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤患者的有效率在70%左右。而在實(shí)體腫瘤的治療中，CD8+CAR-T針對(duì)胰腺癌治療緩解率為17%，其中1例胰腺癌伴肝轉(zhuǎn)移的病例完全治愈了肝臟轉(zhuǎn)移灶，但對(duì)原位癌的清除沒有起到任何效果。另1例靶向神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的CAR-T臨床試驗(yàn)，臨床效果維持了7.5個(gè)月后患者復(fù)發(fā)。這份報(bào)告指出CAR-T針對(duì)實(shí)體腫瘤的治療尚有一定的緩解效率，其在輸注初期的靶向殺傷效力明顯，起到了顯著緩解腫瘤癥狀的作用。然而CD8+CAR-T在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)卻無法完全清除腫瘤細(xì)胞，說明這些臨床試驗(yàn)所采用的CAR-T不具備長(zhǎng)久免疫監(jiān)視、清除腫瘤細(xì)胞的能力。因此，針對(duì)實(shí)體瘤的完全清除，需要CAR-T長(zhǎng)期有效的體內(nèi)增殖以及源源不斷地自我更新補(bǔ)充。因此，具備自我更新能力的記憶性CAR-T是取得抗實(shí)體瘤持久戰(zhàn)勝利的重要保障[7]。

縱觀我國近年來發(fā)布的近50項(xiàng)CAR-T抗實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)，其中包括針對(duì)間皮素的抗胰腺癌CAR-T，針對(duì)磷脂酰肌醇聚糖-3(glypican-3，GPC3)的抗肝細(xì)胞癌CAR-T，針對(duì)上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的抗前列腺癌CAR-T，針對(duì)EB病毒潛伏膜蛋白-1(Epstein-Barr virus latent membrane protein-1，LMP1)的抗鼻咽癌CAR-T，針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(vascular endothelial growth factor receptor-1，vEGFR-1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的抗乳腺癌、宮頸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤CAR-T等產(chǎn)品，雖在實(shí)驗(yàn)室取得了良好的體外抗腫瘤療效，但至今均未能取得振奮人心的臨床數(shù)據(jù)[8-9]。Ma等[10]在總結(jié)2019年中國CAR-T臨床實(shí)體瘤試驗(yàn)情況時(shí)指出，高度致密的實(shí)體腫瘤組織內(nèi)部pH值低、缺氧、營(yíng)養(yǎng)耗竭且具有復(fù)雜的抑制性腫瘤微環(huán)境，使得CAR-T細(xì)胞無法充分趨化、浸潤(rùn)到腫瘤局部，并擴(kuò)增到有效數(shù)量發(fā)揮抗瘤作用，這些因素導(dǎo)致了CAR-T針對(duì)實(shí)體瘤的不良療效。因此，成功的CAR-T方案不僅需要針對(duì)腫瘤抗原高度特異的CAR，同時(shí)也需要能在體外誘導(dǎo)擴(kuò)增出具有良好抗腫瘤效應(yīng)的CAR-T群體，以確保其在體內(nèi)的穩(wěn)定增殖，充分發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤作用，減少CAR-T在體內(nèi)出現(xiàn)自我增殖衰退、細(xì)胞衰老和凋亡，以及因腫瘤內(nèi)環(huán)境引起的損耗。

2 CD8+T細(xì)胞的再分化亞群及功能研究對(duì)CAR-T亞群篩選的意義

2.1 CD8+T細(xì)胞的再分化

CD8+T細(xì)胞的分化過程在感染免疫學(xué)中研究得比較清楚，其活化后可分化為效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞，早期根據(jù)IL-7Rα和殺傷細(xì)胞凝集素樣受體G1(killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1)等細(xì)胞表面標(biāo)志將活化后的CD8+T分為KLRG1lowIL-7Rhigh的記憶前體效應(yīng)細(xì)胞(memory precursor effector cells，MPECs)和KLRG1highIL-7Rlow的短期效應(yīng)T細(xì)胞(short-lived effector cells，SLEC或terminal effector cells，TEFF)[11]。MPECs可進(jìn)一步分化，根據(jù)CD62L、CCR7等表型分子又分為干細(xì)胞樣記憶型T細(xì)胞(stem cell like memory T cell，TSCM)、中樞型記憶T細(xì)胞(central memory T cell，TCM)和效應(yīng)記憶T細(xì)胞(effector memory T cell，TEM)[12]，TCM和TEM都屬于長(zhǎng)壽命記憶T細(xì)胞(long-lived memory T cell)。TEFF具有強(qiáng)細(xì)胞毒作用，大量表達(dá)FasL，分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、穿孔素(perforin)、顆粒酶B(gramzyme B)等眾多細(xì)胞毒性分子應(yīng)對(duì)機(jī)體細(xì)胞的感染或病變。但另一方面，TEFF作為CD8+T細(xì)胞活化后的高效靶向殺傷細(xì)胞群體，增殖潛力受損，PD-1、LAG3等免疫負(fù)向共刺激分子的表達(dá)顯著上調(diào)[13-14]，在機(jī)體免疫自穩(wěn)的調(diào)節(jié)機(jī)制作用下迅速凋亡。這也是抗原和炎癥持續(xù)存在時(shí)TEFF耗竭的重要原因。不同分化亞群的CD8+T細(xì)胞在增殖潛力，遷移歸巢能力，IL-2分泌水平，效應(yīng)功能以及細(xì)胞毒性方面均顯示出了較大差異(圖1)。

Naive T：初始T細(xì)胞；-：不表達(dá)；+：低表達(dá)；++：中度表達(dá)；+++：高表達(dá)

CD8+記憶T細(xì)胞分化亞群的多樣性歸因于初次免疫和記憶應(yīng)答所接受的不同抗原和炎癥環(huán)境刺激的累積。靶抗原的類型、抗原刺激持續(xù)的時(shí)間及炎癥信號(hào)的強(qiáng)弱都會(huì)影響CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能以及再次免疫應(yīng)答反應(yīng)。由圖1可知，初始CD8+T細(xì)胞隨著接受刺激信號(hào)質(zhì)量與強(qiáng)度的積累，啟動(dòng)增殖并逐漸沿著 TSCM→TCM→TEM→TEFF分化軸進(jìn)行分化，該過程伴隨著趨化因子CCR7、淋巴歸巢分子CD62L以及共刺激分子CD27/CD28的逐漸下調(diào)。隨著細(xì)胞接收到的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大，初始T細(xì)胞最終分化為短壽命的TEFF細(xì)胞。TEFF具有高水平IFN-γ分泌能力和極強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，但處于分化的終末狀態(tài)，KLRG1、CD95分子表達(dá)上調(diào)，自我更新能力喪失，衰老性復(fù)制明顯，端粒長(zhǎng)度縮短，凋亡顯著，已是“強(qiáng)弩之末”。

2.2 基于分化早期CD8+T制備CAR-T的優(yōu)勢(shì)

2.2.1 分化早期CD8+T細(xì)胞顯著高表達(dá)淋巴歸巢分子與共刺激分子 Gattinoni教授團(tuán)隊(duì)的多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)分化早期的T細(xì)胞不僅在體外具有很好的靶向腫瘤殺傷作用，同時(shí)也能在體內(nèi)更有效地清除實(shí)體瘤；而分化程度較高的晚期T細(xì)胞在體內(nèi)的治療效果則較差[15]。分析活化早期與晚期T細(xì)胞的基因差異表達(dá)與表面分子標(biāo)志，可見分化早期的T淋巴細(xì)胞顯著高表達(dá)淋巴歸巢分子(如CD62L、CCR7)[16]和共刺激分子(如CD27、CD28)。高表達(dá)的共刺激分子預(yù)示著早期CD8+T細(xì)胞強(qiáng)大的分化和活化潛能，而高表達(dá)的CD62L、CCR7等淋巴歸巢分子可促使活化早期T細(xì)胞制備的CAR-T在體內(nèi)輸注后具有更高的淋巴組織歸巢能力[17]。通過歸巢至腫瘤抗原刺激的淋巴結(jié)能夠更有效增加CAR-T與專職APCs接觸的機(jī)會(huì)，更好地誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤抗原，活化并發(fā)揮殺傷腫瘤的功能。雖然在腫瘤免疫原性極強(qiáng)的情況下CAR-T細(xì)胞歸巢至淋巴結(jié)的必要性不大，但對(duì)于大多數(shù)腫瘤，其抗原性均較弱，因此要徹底清除和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，淋巴歸巢循環(huán)的過程就非常重要，可加強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視[18]。利用終末分化的TEFF制備CAR-T，在輸注后的短期內(nèi)其直接抗腫瘤活性也許很強(qiáng)，且部分實(shí)驗(yàn)研究也表明CD62低表達(dá)的T細(xì)胞亞群比初始T細(xì)胞具有更好的抗腫瘤活性，但缺乏持久的抗腫瘤效應(yīng)和免疫記憶性。因此，過度關(guān)注于研究分化終末期CD8+T細(xì)胞制備CAR-T的抗腫瘤性能，而忽視利用分化早期具有自我更新、免疫記憶和強(qiáng)大增殖潛力等特征的T細(xì)胞制備CAR-T，可能是當(dāng)前多數(shù)CAR-T臨床實(shí)體瘤治療存在的誤區(qū)之一。

2.2.2 細(xì)胞因子的穩(wěn)定獲取是分化早期T細(xì)胞維持增殖和存活的重要條件 分化進(jìn)程中的T細(xì)胞常常會(huì)因?yàn)槿鄙俜€(wěn)定的細(xì)胞因子支持而無法正常增殖和存活，最終喪失抗腫瘤活性。IL-2是重要的淋巴細(xì)胞活性調(diào)節(jié)因子，無論是體外擴(kuò)增腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞，還是體內(nèi)過繼輸入CD8+CAR-T治療時(shí)都應(yīng)給予一定水平的IL-2維持細(xì)胞增殖，撤去IL-2則會(huì)直接導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡[19]。在不同階段的T細(xì)胞分化模型中，只有分化早期的CD8+T細(xì)胞能通過自分泌的方式自給自足高水平的IL-2。幼稚期的T細(xì)胞需要進(jìn)一步的抗原誘導(dǎo)分化才能獲得這種能力，而中晚期的CD8+T細(xì)胞則更多需要在Th1細(xì)胞的幫助下獲得IL-2。因此，能夠穩(wěn)定維持自身IL-2分泌水平、保障了自我增殖能力的早期CD8+T細(xì)胞，初步具備了構(gòu)建高效率CD8+CAR-T的良好特征屬性。

IL-7和IL-15作為IL-2同家族的細(xì)胞因子，是T淋巴細(xì)胞增殖、活化及維持分化的重要分子，對(duì)CD8+記憶T細(xì)胞的生成與存活尤為關(guān)鍵。IL-7Rα亞基(CD127)是分化早期T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)壽命的記憶T細(xì)胞的標(biāo)志之一[20]，且中晚期的T細(xì)胞表達(dá)低水平IL-7Rα不利于其自身的生存。日本學(xué)者制備的“7×19”CAR-T就是基于這一原理[21]，將IL-7和CCL19分子聯(lián)合CAR共表達(dá)，通過增加局部的IL-7和CCL19水平，賦予CD8+CAR-T細(xì)胞額外的增殖能力和趨化能力，幫助其提升實(shí)體瘤殺傷效率，增強(qiáng)體內(nèi)抗瘤能力，獲得了較為理想的效果。IL-15對(duì)維持記憶T細(xì)胞的免疫應(yīng)答有重要作用，并在免疫應(yīng)答結(jié)束時(shí)通常會(huì)促進(jìn)CD8+TCM的生成[22]。IL-15對(duì)過繼轉(zhuǎn)移的CD8+CAR-T的生存和分化具有支持作用，常應(yīng)用于體內(nèi)外CAR-T細(xì)胞增殖和效應(yīng)功能的維持，顯著提高了過繼CAR-T的抗腫瘤療效[23-24]。

IL-21能與IL-7和IL-15產(chǎn)生強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)，共同調(diào)控CD8+T細(xì)胞的增殖。此外，IL-21還可以抑制由IL-15引起的初始CD8+T細(xì)胞CD28、CD62L分子的下調(diào)，使其繼續(xù)發(fā)揮共刺激和淋巴歸巢的能力[25]。Moroz等[26]在早年就揭示了IL-21潛在的抗腫瘤性能，對(duì)比IL-2與IL-15，小鼠腹腔注射IL-21不僅不良反應(yīng)極小，還有效地加倍了50%胸腺瘤小鼠的生存時(shí)間。更進(jìn)一步的研究指出，IL-21治療使荷瘤小鼠生存率提高歸因于CD8+CD27highCD28highCD45RO+記憶型T細(xì)胞的產(chǎn)生[27]。盡管IL-21對(duì)記憶型T細(xì)胞產(chǎn)生的作用機(jī)制還未完全闡明，但其促進(jìn)CD8+CAR-T殺傷腫瘤并誘導(dǎo)生成記憶型CAR-T已獲得不少體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的證實(shí)[28-30]。

2.3 分化晚期CD8+T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)處于明顯劣勢(shì)

復(fù)制性衰老是包括T細(xì)胞在內(nèi)的所有體細(xì)胞的必經(jīng)末路，高表達(dá)KLRG-1的效應(yīng)型記憶CD8+T細(xì)胞增殖潛力受限[31]，從TEM到TEFF，細(xì)胞的復(fù)制能力持續(xù)降低，進(jìn)入不可逆的復(fù)制性衰老期。盡管分化晚期的CD8+T細(xì)胞是腫瘤高度反應(yīng)性的T細(xì)胞，但是這些T細(xì)胞已經(jīng)耗盡了增殖和存活能力，過繼移植這群終末分化期CD8+T細(xì)胞制備的CAR-T，在體內(nèi)凋亡過度，顯然不利于實(shí)體腫瘤的治療。T細(xì)胞活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(AICD)是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)、防止自身免疫性疾病發(fā)生的重要機(jī)制，高度分化的CD8+T細(xì)胞大量表達(dá)CD95/Fas，F(xiàn)as-FasL介導(dǎo)的凋亡途徑活化明顯。與此同時(shí)，促凋亡的BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白BID、BAD也在這群CD8+T細(xì)胞中過度表達(dá)[15]。除此之外，腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制分子PD-1/PDL1/CTLA-4是導(dǎo)致該類細(xì)胞制備的CAR-T在實(shí)體腫瘤中發(fā)生耗竭的重要因素[32]，通過加入抗4-1BB的抗體以及對(duì)PDL1和CTLA-4負(fù)性調(diào)控分子進(jìn)行中和，抑制CD8+T細(xì)胞的過度活化，阻止細(xì)胞的終末分化進(jìn)程，有效減少了CD8+TILs的凋亡，促進(jìn)其在腫瘤局部的有效積聚，提高了CD8+TILs抗實(shí)體腫瘤的能力[33]。

抑制性的腫瘤微環(huán)境是CAR-T實(shí)體瘤療法亟待解決的重大問題。相對(duì)于血液系統(tǒng)腫瘤較弱的免疫信號(hào)抑制，實(shí)體瘤通常被多種類型的促瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，如支持腫瘤生長(zhǎng)的脈管系統(tǒng)，M2型巨噬細(xì)胞(TAMs)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和骨髓來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)等。除此以外，免疫檢查點(diǎn)的抑制信號(hào)及腫瘤組織異常表達(dá)的TGF-β，都是阻遏CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)的重要因素[34]。處于分化晚期的TEFF細(xì)胞，僅具有短期介導(dǎo)腫瘤溶解與破壞的能力，無法長(zhǎng)期在抑制性的腫瘤微環(huán)境中持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞，尤其還要面對(duì)惡性腫瘤中多能癌癥干細(xì)胞的長(zhǎng)期克隆增殖。而處于分化早期的CD8+T細(xì)胞群體，包含了更多的TSCM與TCM，不僅能通過活躍的分化產(chǎn)生更多的高細(xì)胞毒性TEM和TEFF來維持長(zhǎng)時(shí)間的免疫攻擊，還能同時(shí)維持低分化TSCM和TCM的持續(xù)供應(yīng)，不斷刷新細(xì)胞毒性效應(yīng)T細(xì)胞的儲(chǔ)存池[35-37]。這種長(zhǎng)效維持的殺傷方式，可能使具有自我更新、增殖存活和再活化能力的早期T細(xì)胞最終清除所有的腫瘤細(xì)胞，包括多能癌癥干細(xì)胞，從而達(dá)到治愈實(shí)體瘤的可能。

3 干細(xì)胞樣記憶型CAR-T的發(fā)展

隨著CAR編輯技術(shù)的蓬勃發(fā)展，利用基因工程將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建CAR-T也取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。通過編輯干細(xì)胞樣的T細(xì)胞亞群制備CAR-T能有效克服目前過繼免疫治療可能出現(xiàn)的無效增殖、體內(nèi)生存期短和不能介導(dǎo)長(zhǎng)效免疫應(yīng)答的缺陷[38-39]。Xu等[40]在14名接受CD19-CAR-T治療的B細(xì)胞惡性腫瘤患者中研究發(fā)現(xiàn)，CAR-T群體中表現(xiàn)為CD8+CD45RA+CCR7+的特殊亞群顯著促進(jìn)過繼T細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤療效，這群細(xì)胞的數(shù)量是體內(nèi)CAR-T持續(xù)增殖的唯一關(guān)鍵，也是持久抗腫瘤的重要保證。這一特殊的細(xì)胞群體符合記憶性T細(xì)胞的特征，并在IL-7和IL-15的支持下具有更優(yōu)良的抗腫瘤特性。過繼輸入具有干細(xì)胞特征的CAR-T進(jìn)行腫瘤免疫治療，可誘導(dǎo)產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞并長(zhǎng)期存活。這一現(xiàn)象在其他血液系統(tǒng)腫瘤的治療中也得到印證[41]。相對(duì)于同時(shí)期的標(biāo)準(zhǔn)CD19-CAR-T治療組，在急性B淋巴細(xì)胞性白血病的NSG模型小鼠中，使用具有干細(xì)胞特性的記憶T細(xì)胞制備的CAR-T治療，可產(chǎn)生100%的緩解效率[29]。

利用干細(xì)胞樣記憶型T細(xì)胞制備的CAR-T在血液腫瘤患者體內(nèi)具有持久的療效，促使研究者嘗試將具有干細(xì)胞性質(zhì)的T淋巴細(xì)胞應(yīng)用于CAR-T實(shí)體腫瘤治療。從CD8+T干細(xì)胞潛能的Waddington模型可以看出[42]，類干細(xì)胞的功能屬性和信號(hào)通路在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育分化成熟的各個(gè)亞群中具有共享性，即終末分化階段前的各淋巴T細(xì)胞亞群均具有分化為記憶T細(xì)胞的能力。初始T淋巴細(xì)胞通過漸進(jìn)分化持續(xù)過渡為終末效應(yīng)T細(xì)胞，在此分化過程中雖然其干細(xì)胞特征逐步弱化，但這些階段產(chǎn)生的各種記憶型T細(xì)胞都維持有一定的干細(xì)胞特征，是維持人體免疫的中堅(jiān)力量。因此，在CD8+CAR-T實(shí)體瘤治療方面，除終末效應(yīng)T細(xì)胞之外，各階段的記憶淋巴細(xì)胞亞群都可能是CAR-T很好的來源，但尚需要大量的研究證實(shí)和優(yōu)化。

4 小結(jié)與展望

目前用于制作CD8+CAR-T進(jìn)行過繼免疫治療的方法基本都屬于20多年前開發(fā)策略的延續(xù)，當(dāng)時(shí)T細(xì)胞分化對(duì)體內(nèi)抗腫瘤療效的影響尚未得到充分認(rèn)知。這些誘導(dǎo)方法過度注重對(duì)T細(xì)胞強(qiáng)有力的體外活化刺激，包括使用CD3單克隆抗體、高濃度的IL-2和高特異性抗原肽致敏，從而獲得了大量腫瘤反應(yīng)性CAR-T，雖然其在體外可分泌高水平IFN-γ，儲(chǔ)備了大量的穿孔素和顆粒酶，對(duì)靶腫瘤細(xì)胞具有非常強(qiáng)大的直接殺傷能力，但不可避免地推動(dòng)了T細(xì)胞走向終末分化，進(jìn)入衰老的進(jìn)程。終末分化的TEFF喪失多種功能，表現(xiàn)為① 淋巴歸巢和共刺激分子表達(dá)下調(diào)；② 不能分泌大量的IL-2和穩(wěn)定獲得細(xì)胞因子； ③ 進(jìn)入凋亡和復(fù)制性衰老狀態(tài)； ④ PD-1/LAG3/CTLA-4等負(fù)性分子表達(dá)上調(diào)。而分化早期的CD8+T細(xì)胞干細(xì)胞樣標(biāo)志明顯，自我更新能力強(qiáng)、具有持續(xù)的分化能力和免疫記憶功能。包括TSCM、TCM在內(nèi)的早期記憶型T細(xì)胞表達(dá)高水平的共刺激分子和歸巢受體，具有穩(wěn)定的細(xì)胞因子自分泌與攝取能力，可以在腫瘤局部進(jìn)行良好的自我更新與補(bǔ)充。因此，對(duì)不同CD8+T分化狀態(tài)、功能特性進(jìn)行比較與總結(jié)，免疫過繼療法中CD8+T淋巴細(xì)胞的選擇應(yīng)該涵蓋對(duì)其4個(gè)基本方面的考察： ① 體外腫瘤殺傷效力；② 體內(nèi)活化能力； ③ 增殖能力； ④ 存活能力和免疫記憶能力。這4個(gè)方面的T細(xì)胞評(píng)估對(duì)CAR-T實(shí)體腫瘤治療具有重要意義。