鮑曼不動桿菌OmpA經ROS/NLRP3信號通路調控THP-1細胞自噬和凋亡

戴曉玥，吳亮，夏雯，陰晴，鄒治情，周亞玲，何蕾，丁龍坤，席月，張有江，許化溪

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇 鎮江 212001； 3. 揚州市廣陵區疾病預防控中心，江蘇 揚州 225001)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是引起呼吸機相關性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)的主要病原菌[1]，患者上呼吸道黏膜表面定植的鮑曼不動桿菌是VAP的重要來源[2]。目前已知的鮑曼不動桿菌毒力因子包括外膜蛋白(outer membrane protein, Omp)，磷脂酶D和外膜囊泡等，其中OmpA是外膜蛋白中表達量最高的一種，參與鮑曼不動桿菌外膜囊泡組裝以及細菌黏附和侵入等過程[3]。近來研究發現，OmpA也存在于鮑曼不動桿菌外膜囊泡中，通過外膜囊泡攜帶傳遞至遠處發揮致病作用，同時破壞宿主細胞線粒體完整性，誘發細胞凋亡[4]或壞死[5]，與鮑曼不動桿菌誘發的VAP嚴重程度密切相關。鮑曼不動桿菌野生株誘導人喉表皮樣癌Hep-2細胞凋亡能力顯著強于OmpA基因敲除株，且OmpA基因敲除株明顯喪失對宿主肺泡上皮細胞的黏附能力[6]。研究發現[7]，將OmpA基因轉染HeLa細胞后可誘發細胞自噬。攜帶OmpA基因的慢病毒轉染RAW 264.7細胞48 h后可引起細胞含NLR家族Pyrin域NOD樣受體家族3(NLRP3)炎癥小體激活和炎癥因子表達上調[8]。此外，OmpA靶向作用于線粒體并誘導產生活性氧，誘發樹突狀細胞凋亡和壞死[6]，但OmpA毒力蛋白的確切致病機制目前仍不清楚。因此，本研究采用原核表達技術制備重組OmpA蛋白[9]，通過免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，建立鮑曼不動桿菌OmpA毒力蛋白的快速檢測方法；同時研究OmpA對THP-1細胞自噬與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和細胞株 感受態細胞E.coliDH5α和BL21(DE3)為本實驗室保存；質粒pTG19-T購自上海捷瑞生物科技公司；pET28a(+)購自德國Novagen公司；鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC 19606由南京鼓樓醫院檢驗科周萬青博士惠贈；人單核THP-1細胞購自上海細胞庫，由本實驗室自行保種和培養。清潔級雄性新西蘭兔，3只，6周齡，體質量2.5～3 kg，由江蘇大學實驗動物中心提供(合格證號：0001330)，在江蘇大學動物中心清潔級環境下飼養。

1.1.2 主要試劑及儀器 細菌培養箱(美國Thermo Fisher公司)；PCR儀(美國ABI公司)；LB培養基(英國Oxoid公司)；氨芐西林(Amp)、X-gal、卡那霉素和IPTG、細菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒和DNA 標準參照物均購自上海捷瑞生物科技公司；2×TaqMaster Mix、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑(SYBR Green染料法)、Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒和總RNA提取試劑盒均購自南京諾唯贊公司；瓊脂糖為西班牙進口產品分裝；限制性內切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ均為美國Thermo Fisher公司產品；T4DNA連接酶(大連TaKaRa公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；引物由蘇州泓迅生物科技公司合成；含鎳的親和樹脂Ni-NTA(德國Qiagen公司)；弗氏完全佐劑和不完全佐劑(美國Sigma公司)；免疫印跡系統及凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；β-肌動蛋白、Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3 B片段(LC3B)抗體均為美國ABclonal生物科技公司產品；其余生化試劑均為國產分析純；基因測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑曼不動桿菌OmpA克隆 復蘇鮑曼不動桿菌標準株ATCC 19606，挑單個菌落于35 ℃中振搖培養12～16 h(200 r/min)；取200 μL菌液用于細菌基因組DNA抽提，操作過程嚴格按照試劑盒操作說明書進行。根據鮑曼不動桿菌OmpA開放閱讀框序列(AY485227)，使用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，正向(5′→3′)：ACAGGATCCATGAAATTGAGTCGTATT(BamH Ⅰ)，反向(5′→3′)：ACAAGCTTTTATTGAGCTGCTGCA(Hind Ⅲ)，擴增OmpA編碼基因。PCR反應總體系為25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，各條引物(25 μmol/L)各0.5 μL，模板2 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環；72 ℃ 10 min。產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并切膠純化后與pTG19-T載體連接，導入感受態細胞E.coilDH5α；將其涂布于含50 μg/mL Amp、20 μg/mL X-gal和10 μg/mL IPTG的LB瓊脂平板，于37 ℃中培養12 h；藍白斑篩選陽性克隆，并挑取陽性克隆經PCR法驗證后送上海生工生物工程公司測序分析。

1.2.2 OmpA/pET-28a表達質粒的構建 將經測序確認無誤的OmpA/pTG19-T質粒與原核表達載體pET-28a質粒經限制性內切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，切膠回收OmpA目的片段和pET-28a載體大片段，在T4連接酶作用下16 ℃過夜連接；次日轉化感受態細胞E.coilDH5α，挑取菌株經搖菌擴增后提取質粒，以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定陽性克隆，繼續轉化感受態細胞E.coilBL21，用于后續重組OmpA表達純化。

1.2.3 重組OmpA蛋白表達純化 轉化后的BL21菌株接種于含硫酸卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養基，于37 ℃中200 r/min孵育12 h；次日取新鮮飽和菌液按1 ∶100比例接種新LB培養液并繼續增菌至D(600 nm)=0.6；分別加入終濃度為1 mmol/L或0.4 mmol/L IPTG，并分別在25 ℃和30 ℃下誘導表達，誘導時間為2、4、6、8 h；然后行8 000 r/min離心，收集菌體并重懸于200 μL雙蒸水中，經超聲裂解后取上清液行SDS-PAGE，檢測不同時間點重組OmpA表達量。在最佳誘導劑濃度和最佳誘導時間下大量增菌，離心收集細菌并重懸于結合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH=8.0)，冰上超聲裂解菌體；以16 000 r/min離心20 min；收集上清液并與Ni-NTA介質充分結合，用洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH=8.0)沖洗Ni-NTA親和層析柱至穿流液D(280 nm)<0.01；最后以洗脫緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH=8.0)洗脫結合蛋白，純化產物經SDS-PAGE后以考馬斯亮藍染色觀察純化結果。

1.2.4 OmpA多克隆抗體制備及抗體水平檢測

1.2.4.1 OmpA多克隆抗體制備 純化的重組OmpA蛋白與等量弗氏完全佐劑充分乳化，以背部皮內多點注射法免疫新西蘭兔，免疫量為1 mg/只。每次免疫前采兔耳緣靜脈血用于效價測定，首次免疫后分別于第3周和第5周行再次免疫以提高抗體效價，第2次和第3次免疫均使用弗氏不完全佐劑。采用ELISA法檢測兔血清中抗OmpA-IgG血清滴度，以羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000)為二抗，酶標儀檢測D(450 nm)。當抗體效價大于1 ∶320 000時，經心臟采血并分離血清用于續研究。

1.2.4.2 蛋白質印跡法檢測臨床菌株OmpA表達 以自制兔多抗檢測鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC 19606和6株臨床分離鮑曼不動桿菌。以兔血清為一抗，采用蛋白質印跡法檢測鮑曼不動桿菌臨床菌株OmpA表達。血平板上刮取1個菌落并與20 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻，煮沸10 min；經12 000 r/min離心2 min；取上清液行SDS-PAGE。80 V 120 min；350 mA 90 min轉印至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；自制抗血清(1 ∶4 000稀釋)于4 ℃振搖過夜；TBST洗滌3次，每次15 min；加入羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000)孵育1 h；TBST洗滌3次；用ECL化學發光顯色試劑盒顯影，照相記錄結果。

1.2.4.3 鮑曼不動桿菌感染患者血清中OmpA抗體水平檢測 取適量重組OmpA蛋白與上樣緩沖液充分混勻，煮沸，行SDS-PAGE。選擇4例行機械通氣的VAP患者，根據患者臨床癥狀和微生物培養結果確認為鮑曼不動桿菌感染。以患者血清為一抗，羊抗人IgG-HRP為二抗，采用蛋白質印跡法，檢測患者插管前和VAP發生時(間隔時間大于14 d)血清中OmpA抗體(IgG型)水平，方法同“1.2.4.2”。

1.2.5 重組OmpA對THP-1細胞炎癥、自噬及凋亡作用的影響

1.2.5.1 THP-1細胞與重組OmpA共孵育及分組

THP-1細胞按常規方法培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5% CO2環境中穩定傳代至第6代用于本研究。取對數生長期細胞接種于6孔板(1×106個/孔)，37 ℃、5% CO2培養過夜；次日加入終濃度為100 μg/mL的佛波酯誘導成貼壁巨噬細胞狀態；待細胞完全貼壁后分別加入終濃度為1 μg/mL和10 μg/mL的重組OmpA蛋白，同時設未加重組蛋白為陰性對照組，繼續培養1 h、3 h和6 h，收集細胞用于后續檢驗。

1.2.5.2 蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白LC-3和Beclin-1表達 棄細胞培養液，每孔加入100 μL RIPA裂解液于冰上裂解15 min；12 000 r/min離心10 min；收集上清液用于蛋白質印跡法檢測，方法同“1.2.4.2”。一抗LC-3抗體、Beclin-1抗體、β-肌動蛋白抗體均1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；二抗羊抗兔IgG-HRP 1 ∶1 000稀釋，于室溫孵育1 h；ECL化學發光試劑盒顯色，Image J軟件分析蛋白相對表達量。

1.2.5.3 流式細胞術檢測細胞凋亡及活性氧產生水平 采用Annexin V-FITC/PI法檢測THP-1細胞凋亡，DCFH-DA探針法檢測THP-1細胞活性氧產生，操作方法嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.2.5.4 qRT-PCR法檢測NLRP3、Caspase-1和IL-1β等mRNA表達NLRP3、Caspase-1、IL-1β和GAPDH等mRNA引物序列見表1。采用Trizol法提取細胞總RNA，以Oligo(dT)為引物合成cDNA鏈。qRT-PCR法反應總體系20 μL，包括SYBR Green Master混合物10 μL，上下游引物各(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA 2 μL。反應程序：95 ℃預變性1 min，95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，反應共計40個循環。實驗中樣本mRNA的Ct值通過GAPDH的Ct值均一化，即ΔCt=Ct樣本-Ct內參，樣本基因mRNA相對豐度值以2-ΔΔCt值表示。

1.3 統計學分析

表1 引物序列

2 結果

2.1 OmpA編碼基因的擴增

以ATCC 17606菌株DNA為模板，PCR擴增產物長度為1 071 bp，與預期大小一致。

2.2 OmpA/pET-28a載體酶切鑒定

OmpA/pET-28a載體經BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，載體的插入片段長度與目的基因片段大小一致。基因測序結果表明，插入片段基因序列與鮑曼不動桿菌OmpA基因(AY485227)序列一致，OmpA/pET-28a載體構建成功。

2.3 重組OmpA表達純化

在不同的時間、溫度和誘導濃度下，電泳結果顯示，菌株在30 ℃和0.4 mmol/L IPTG條件下誘導8 h可獲得最大重組OmpA蛋白產量。經Ni-NTA親和層析法純化后，純化產物經SDS-PAGE可見38 000處有一條清晰條帶，即為重組OmpA蛋白(圖1)。BCA法測定濃度為3.25 mg/mL，SDS-PAGE結果表明重組OmpA蛋白分子質量與預測值相符。

M：蛋白分子標準參照物；A：1，未經IPTG誘導菌；2，經IPTG誘導菌；B：1，穿流液；2，洗脫液

2.4 臨床菌株OmpA蛋白表達

各株菌中均可檢出OmpA表達，而大腸埃希菌BL21株中無反應，表明自制多抗可以識別臨床菌株OmpA蛋白。見圖2。

1：大腸埃希菌BL21；2：鮑曼不動桿菌ATCC19606；3～8：6株臨床菌株

2.5 患者血清中OmpA抗體表達

結果表明，4位VAP患者氣管插管前后血清中均可以檢出IgG型OmpA抗體，且VAP發生時患者血清中OmpA抗體水平顯著高于氣管插管前(P均<0.05)。見圖3。

2.6 OmpA誘導THP-1細胞自噬

1，3，6 h時，10 μg/mL組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白相對表達量較對照組顯著增加(P<0.05)，并且LC3-Ⅱ在6 h和Beclin-1在1、3 h相對表達量顯著高于1 μg/mL組(P均<0.05)。由此可見，隨著重組OmpA蛋白作用時間延長，10 μg/mL組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達量逐漸升高，呈一定的時間依賴性。見圖4。

1～4：患者編號；a：P<0.05，與插管前比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與同時間1 μg/mL組比較

2.7 重組OmpA蛋白誘導THP-1細胞凋亡發生

1，3，6 h時，10 μg/mL組THP-1細胞凋亡率顯著高于1 μg/mL組(P均<0.05)和對照組(P均<0.05)，而1，3 h時，1 μg/mL組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。作用6 h時，1 μg/mL組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。由此可見，重組OmpA蛋白10 μg/mL作用THP-1細胞后，細胞凋亡率呈一定的時間依賴性。見圖5。

2.8 重組OmpA蛋白誘導NLRP3炎癥小體活化

1 h時，1 μg/mL和10 μg/mL組IL-1βmRNA表達量較對照組顯著升高(P均<0.01)。3 h時，10 μg/mL組NLRP3mRNA和Caspase-1mRNA表達量顯著高于1 μg/mL組(P均<0.05)和對照組(P均<0.01)，而1 μg/mL組和對照組間二者表達量差異無統計學意義(P>0.05)。

3 h時1 μg/mL和10 μg/mL組IL-1βmRNA表達量與自身對應1 h相比，明顯降低(t=5.24, 10.92,P均<0.05)。6 h時，10 μg/mL組NLRP3mRNA和Caspase-1mRNA表達量較3 h時顯著降低(t=5.59,10.79,P均<0.05)，與對照組差異無統計學意義(P>0.05)；而1 μg/mL組THP-1細胞NLRP3mRNA和Caspase-1mRNA表達量顯著高于10 μg/mL組(t=8.91, 7.03,P均<0.05)和對照組(t=10.00, 8.00,P均<0.05)。見圖6。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與同時間1 μg/mL組比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較；c：P<0.05，與同時間1 μg/mL組比較

2.9 重組OmpA蛋白誘導THP-1細胞活性氧生成

1 h時，1 μg/mL組和10 μg/mL組活性氧含量均明顯高于對照組(t=16.33,t=15.57,P均<0.01)，且10 μg/mL組明顯高于1 μg/mL組(t=4.39,P= 0.048)；10 μg/mL組作用3 h時活性氧含量較1 h時明顯下降(t=11.68,P= 0.007)，6 h活性氧含量較3 h時變化無統計學意義。見圖7。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較；c：P<0.05，與同時間1 μg/mL組比較

3 討論

Beclin-1(酵母ATG6同源物)是重要的自噬調控蛋白；此外，當自噬發生時胞質中LC3-Ⅰ經加工轉變為LC3-Ⅱ并定位于自噬體膜。因此通過檢測兩種LC3蛋白表達量的比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和Beclin-1蛋白表達量可評估細胞自噬發生[9-10]。Jin等[11]通過敲除鮑曼不動桿菌OmpA基因構建外膜囊泡不含OmpA的缺陷菌株，并發現該缺陷株誘導宿主細胞自噬和死亡能力較野生株明顯減弱。本研究結果表明，鮑曼不動桿菌重組OmpA蛋白可以體外誘導THP-1細胞自噬和凋亡，且隨重組蛋白濃度升高和作用時間延長而增強。由此推測，在感染早期，大量宿主免疫細胞的自噬和凋亡有助于控制感染擴散，并加速機體對病原體的清除。

免疫細胞釋放的炎癥因子是固有免疫的重要組成部分，而由NLRP3、Caspase-1和凋亡相關斑點樣蛋白組成的NLRP3炎癥小體的激活是啟動免疫防御的關鍵[12]，但NLRP3的過度激活又會導致宿主正常組織損傷[13]。我們前期研究發現，鮑曼不動桿菌可以激活宿主巨噬細胞NLRP3炎癥小體的活化[14]。本研究中則進一步證實鮑曼不動桿菌的重要毒力蛋白OmpA可以導致NLRP3炎癥小體活化和活性氧產生，且該能力似乎隨著OmpA蛋白作用濃度升高而增強，在作用后期均下降。由此推測，在鮑曼不動桿菌感染初期，細菌OmpA刺激宿主巨噬細胞，激活NLRP3炎癥小體并產生大量活性氧發揮殺傷病原體效果；隨著感染持續活性氧等炎癥因子會誘發巨噬細胞自噬發生以抑制炎癥小體的激活，防止機體過度炎癥反應以避免正常細胞和組織損傷。

機體可通過適度自噬下調炎癥水平，其機制可能是通過清除受損的線粒體從而減少活性氧及線粒體DNA釋放，以抑制炎癥小體的活化，并且凋亡相關蛋白BCL家族成員能抑制NLRP1自身寡聚化，繼而抑制Caspase-1活化及IL-1β成熟[15]。本研究結果顯示，在高濃度OmpA或長時間作用下，THP-1細胞NLRP3炎癥小體的激活被細胞自噬所抑制，其結果可能會阻礙病原體的識別和清除，有利于病原體持續在宿主體內存活和增殖，并引起嚴重感染癥狀。而自噬對炎癥反應的抑制存在兩面性，適度的自噬水平可以維持機體內環境穩定，防止重要器官因過度炎癥反應而損傷[16]。

綜上所述，OmpA是鮑曼不動桿菌的重要毒力蛋白，可以誘發宿主巨噬細胞自噬、凋亡，并可以激活NLRP3炎癥小體。患者體內自噬水平和炎癥水平與疾病的發生、發展和預后密切相關，通過調節患者體內自噬水平可以降低感染后炎癥損傷。