非編碼RNA GlmY對傷寒沙門菌生物膜形成的影響

李雪，趙昕，靳夢彤，唐浩，張盈，黃新祥

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 南京市第一醫院核醫學科，江蘇 南京 210006)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S. Typhi)是一種以人類為唯一宿主的腸道致病菌，主要通過受污染的食物或水經消化道入侵人體，突破免疫防御引起全身性感染(傷寒)[1- 2]。S. Typhi可黏附在某些非生物固體甚至人體膽石表面，形成大量高度組織化、系統化的細菌群落——生物膜，該膜結構的形成能夠使細菌抵抗環境壓力和抗生素，并逃避宿主免疫系統的攻擊，增強其在宿主體外的傳播持久性及體內定植[3]。生物膜的形成受到龐大而復雜的調控網絡控制，包括許多轉錄和轉錄后調控因子，例如雙組分調節體系，σ因子和非編碼RNA等[4- 5]。

RNA不具有編碼功能，廣泛存在于各種微生物及動植物。多種細菌中均已鑒定出多種具有調控作用的非編碼RNA(ncRNA)[6]，它們大多通過與對側或遠端靶mRNA形成完全或不完全堿基配對的方式來發揮作用[7-8]。本課題組前期利用RNA-seq技術對生物膜及浮游狀態的S. Typhi進行轉錄組分析，發現ncRNA GlmY在生物膜中的表達水平明顯高于浮游菌(尚未發表)。GlmY可與ncRNA GlmZ 協同作用來調節胞內葡萄糖胺-6-磷酸的含量[9],但其在細菌生物膜形成中的作用尚未可知，因此本研究擬探討GlmY對S. Typhi生物膜形成的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

傷寒沙門菌野生株S. Typhi GIFU10007、E.coliλ372和自殺質粒pGMB151由日本岐阜大學醫學院微生物學教研室饋贈；E.coliDH5α、glmY缺陷株、回補株、空質粒對照株由本實驗室制備或保存；pBAD/myc-HisA為美國Promega公司產品。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(德國Oxoid公司)；限制性核酸內切酶BamH Ⅰ，T4DNA連接酶(大連TaKaRa公司)；Trizol、氯仿(美國Sigma公司)；超保真DNA聚合酶、逆轉錄試劑、SYBR熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；96孔圓底細胞培養板(美國Corning公司)。凝膠成像儀(美國Gene Genius Bio Imaging System)；核酸紫外檢測儀(德國Eppendorf公司)；PCR儀(美國Applied Biosystems?2720)；cfx96熒光定量PCR儀，電轉化儀均為美國Bio-Rad公司產品。設計各種引物，具體見表1，下劃線為酶切位點/接頭序列。引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。

1.3 glmY缺陷株構建

S. TyphiglmY缺陷株依照參考文獻方法構建[10]，分別設計glmY上下游特異性引物P1A/P1B、P2A/P2B，以S. Typhi 野生株DNA為模板，用重疊PCR獲得重組片段，并插入自殺質粒 pGMB151BamH Ⅰ位點，將重組質粒電轉導入S. Typhi野生株，經5%蔗糖板傳代培養篩選，獲得穩定重組的glmY缺陷株。

表1 引物序列

1.4 細菌生物膜形成檢測

細菌生物膜形成實驗參考文獻[11]，分別將野生株和glmY缺陷株接種于20 mL胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基培養至D(600 nm)=0.4。離心收集菌體，用TSB重懸并轉種入96孔U型底細胞培養板，30℃靜置培養96 h。實驗行3次生物學重復。

1.5 細菌總RNA提取及qRT-PCR檢測

細菌總RNA提取及qRT-PCR依照參考文獻[11]，分別挑取待測菌株的單菌落以“1.4”中方法培養至D(600 nm)=0.4，離心收集菌體，Trizol法提取總RNA并消化基因組DNA。取2 μg總RNA用特異性或隨機引物進行逆轉錄。將野生株基因組DNA梯度稀釋(至少5個梯度)制作各待測基因qRT-PCR的標準曲線，同時，將逆轉錄產物適當稀釋后作為模板，用qRT-PCR檢測待測基因和內參基因16 S mRNA水平。實驗行3次生物學重復。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 成功制備glmY缺陷變異株

為制備glmY缺陷變異株，采用自殺質粒同源重組的方法來敲除目的基因。以S. Typhi野生株基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得glmY上、下游同源片段F1(423 bp)、F2(435 bp)，如圖1A。利用重疊PCR獲得F1+F2定向連接產物作為重組DNA片段(圖1B)，連接自殺質粒，熱擊導入E.coliλ372感受態細胞。提取經PCR及序列分析驗證后的陽性克隆重組質粒，電擊轉入S. Typhi野生株中，用蔗糖誘導重組，PCR 擴增glmY篩選菌株，最后獲得傳代穩定的glmY缺失變異株(圖1C)。

M: DL2000 DNA標準參照物；A：PCR擴增同源片段；1，同源片段F1；2，同源片段F2；B：重疊PCR擴增同源片段；1，陰性對照；2，F1+F2定向連接產物；C：PCR篩選重組菌株；S，陽性對照；L，陰性對照；1～8，穩定變異株的PCR擴增結果

2.2 GlmY可增強傷寒沙門菌生物膜形成能力

結晶紫染色結果如圖2所示，與野生株相比，缺陷株的生物膜染色形成明顯降低(t=25.57，P<0.01)，表明GlmY缺失可減弱S. Typhi野生株的生物膜形成能力。

圖2 S. Typhi生物膜形成分析

2.3 GlmY影響生物膜相關基因表達水平

為進一步探究GlmY通過何種調控途徑來影響生物膜形成，本研究選取11個生物膜形成要素的相關基因(菌毛：csgD、csgA、fimA；胞外多糖：yihP、rfaD、wcaA；鞭毛：flhD、fliA、fljB；纖維素：bcsA；表面蛋白：bapA)，并用qRT-PCR檢測野生株和缺陷株中上述基因的mRNA水平。如圖3所示，與野生株相比，缺陷株中csgD和csgA的mRNA水平明顯下降(P<0.01或<0.05)，同時缺陷株中胞外多糖相關基因yihP、rfaD、wcaA及纖維素相關基因bcsA的mRNA表達均有不同程度的上調(P均<0.05或<0.01)，其余相關基因mRNA表達差異無統計學意義(P均>0.05)。

圖3 野生株與glmY缺陷株生物膜形成相關基因mRNA相對表達水平

3 討論

為探究在S. Typhi生物膜形成中具有調控作用的ncRNA，本課題組前期利用Solexa高通量測序技術對不同狀態下的S. Typhi進行轉錄組分析，發現生物膜狀態下的S. Typhi ncRNA GlmY表達水平較高。研究發現，ncRNA GlmY可協同ncRNA GlmZ促進GlmS翻譯[9,12]。glmS基因編碼的谷氨酰胺合酶為細菌合成細胞壁主要成分N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸所必需。本研究在成功構建glmY缺陷株基礎上進行生物膜形成試驗，發現glmY缺陷株生物膜形成能力明顯低于野生株。同時，發現GlmY缺失可下調卷曲菌毛合成相關基因csgD和csgA的mRNA水平，但上調胞外多糖和纖維素合成相關基因的mRNA水平，推測GlmY對卷曲菌毛、胞外多糖及纖維素的合成均有調控作用，但以前者的作用為主。由此揭示GlmY有可能通過促進S. Typhi的卷曲菌毛合成進而調節生物膜形成。

已知卷曲菌毛是S. Typhi生物膜的主要蛋白成分[13]，CsgD作為卷曲菌毛合成中的關鍵轉錄調節因子，不僅負責調控csgBA操縱子(編碼主結構蛋白CsgA和成核蛋白質CsgB)和csgDEFG操縱子(編碼纖維組裝和分泌所需的蛋白質)的表達[14-15]，同時csgD轉錄本還是生物膜調控網絡的信號樞紐，受到許多小的ncRNA調控。如OmrA，OmrB，McaS，RprA，GcvB等這些已知的小RNA均可通過與csgDmRNA直接結合或間接作用來促進或者抑制csgD表達[16-18]。本研究雖然發現GlmY可下調csgD和csgA的mRNA水平，但并未確定二者是否為GlmY的新靶標。此外，GlmY缺失后，有部分與生物膜形成相關的基因的mRNA表達呈上升趨勢，其作用及機制有待進一步研究。