基于高通量測序的技術檢測梨樹病毒

楊潔萍，周 麗，馬 麗，全紹文，覃 陽，牛建新

(石河子大學農學院園藝系/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】果樹為多年生植物，以無性繁殖為主。病毒多為系統侵染，被侵染后樹體周身帶病毒且終生受害，輕者樹體生長不良，果實產量下降，品質變劣；重者樹體衰退枯死或造成果實畸形，失去商品價值[1]。建立高靈敏度、快速、高通量的病毒檢測技術，對應用于植物病毒病的早期預警預防有重要意義。【前人研究進展】自發現第一種植物病毒病以來，植物病毒的檢測技術也在不斷發展，常規的檢測手段包括生物學鑒定法、電子顯微鏡觀察法、血清學檢測法和分子生物學檢測法等[2-3]。分子生物學檢測方法已廣泛的應用于梨、蘋果等果樹病毒的檢測鑒定[4-7]，大多數果樹病毒和病原體的特異性和敏感性檢測主要基于分子技術。近年來，推出和發展了第二代測序技術(Next-generation sequencing，NGS)[8-9]，因其快速和靈敏的特點已應用于發現和鑒定已知和未知病毒，已在葡萄[10-12]、蘋果、梨[13]和櫻桃[14]等果樹上應用，發現了多種感染果樹的新病毒[15,16]。庫爾勒香梨(Pyrusbrestschneideri)是新疆的名優特產，其獨特的風味品質。但庫爾勒香梨樹體普遍攜帶病毒，已明確鑒定的梨病毒有5種[17]，即蘋果莖溝病毒(Apple stem groove virus，ASGV)、梨環紋花葉病毒(Pear ring pattern mosaic virus，PRPMV)即蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、梨脈黃病毒(Pear vein yellow virus, PVYV)即蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)、梨石痘病毒(Pear stony pit virus, PSPV)和榅桲矮化病毒(Quince stunt virus, QSV)。盧永燦[18]建立了檢測3種梨病毒ASGV、ASPV和ACLSV的實時熒光定量RT-PCR技術及ASPV和ACLSV的環介導等溫擴增技術；牛建新等[19-20]利用原位PCR檢測了庫爾勒香梨的ACLSV、建立了ASPV、ACLSV和ASGV的多重RT-PCR檢測技術；黃妍妍等[21]利用TC-RT-PCR、IC-RT-PCR、RT-PCR技術檢測了ASGV，并比較3種檢測技術的靈敏性；劉娜等[22]克隆了ASPV分離株KL1、KL9的全基因組；孫曉霞等[23-24]利用高通量測序技術獲得了庫爾勒香梨的ASGV的全基因組和啤酒花矮化類病毒的序列。【本研究切入點】庫爾勒香梨樹體普遍帶有病毒，導致香梨產量降低、風味品質變劣，給香梨生產帶來巨大隱患。已有利用生物學鑒定法、血清學檢測法、分子生物學檢測法等多種方法檢測梨病毒的研究，但沒有利用高通量測序技術來檢測庫爾勒香梨病毒相關研究，并驗證其可靠性。傳統檢測方法耗時長、需要對病原物的生物學特征、血清學特征、理化特征、基因組結構特征有預先的了解[25]，而高通量測序技術檢測可以不依賴對已知病原物特征的了解而對病毒進行鑒定。研究基于高通量測序的技術檢測梨樹病毒。【擬解決的關鍵問題】以庫爾勒香梨花朵為試材，通過高通量測序技術進行轉錄組測序分析，篩選與植物病毒相關的基因序列，采用RT-PCR技術對候選病毒有關的基因序列進行驗證，研究檢測梨病毒種類的新方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014年、2017年、2018年4月中旬，在庫爾勒沙依東園藝場香梨園隨機選取若干庫爾勒香梨樹采集花朵，包于錫箔紙中立即投入液氮速凍保存，帶回實驗室存放于-80℃，用于轉錄組測序。2018年10月，在庫爾勒沙依東園藝場香梨園隨機選取若干庫爾勒香梨樹，采集枝條，用濕布包裹帶回實驗室存放于4℃，用于后續RT-PCR驗證。

1.2 方 法

1.2.1 轉錄組測序及序列

將3年采集的庫爾勒香梨花朵分別于當年送至諾禾致源公司，委托其利用Illumina HisSeqTM2500測序平臺進行轉錄組測序。將獲得的原始序列過濾剔除低質量數據得到干凈序列(clean data)后，采用Trinity[26]對clean reads進行拼接。Trinity 拼接得到的轉錄本序列，采用Corset[27]利用比對上轉錄本的reads數和表達模式對轉錄本進行層次聚類，以Corset層次聚類后得到最長Cluster序列進行基因功能注釋，篩選出注釋為植物病毒的長片段序列作為候選病毒進行后續分析。

2014年、2017年、2018年庫爾勒香梨花朵轉錄組測序分別記為T1、T2、T3。

1.2.2 總RNA提取

采用EASYspin Plant microRNA Kit (Aidlab)試劑盒，提取庫爾勒香梨枝條的韌皮部總RNA，按照說明書操作。檢驗總RNA的質量用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白濃度測定儀(Nanodrop 2000)測定。

1.2.3 RT-PCR 驗證

采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒進行反轉錄反應，合成的cDNA立即放于-20℃冰箱保存。

利用Primer 5.0軟件設計引物，引物序列見表1。PCR 引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR 反應體系為20 μL，其中 cDNA 2 μL，2XTaqPCR Master Mix 10 μL，正反引物各1 μL，ddH2O 7 μL。 PCR擴增程序為 ：94℃預變性90 s；94℃變性 30 s，X℃退火30 s(退火溫度因引物而異)，72℃延伸1 min，35個循環；72℃最后延伸5 min；4℃保存。PCR 產物取5 μL用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。每對引物重復試驗3次，確定結果的準確性。表1

表1 病毒 RT-PCR 檢測引物Table 1 Primer of RT-PCR for virus detection

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序

研究表明,T1轉錄組測序共獲得107 202 492個原始序列，經過濾共得到103 466 288個clean reads，GC含量平均為47.04%，Q20和Q30 分別平均為 97.64%、93.18%。此次樣品測序數據可作為后續轉錄本拼接的參考序列。對所獲得的讀序進行拼接得到了100 690個轉錄本，平均長度為 1 081 bp，對轉錄本序列進一步對序列進行層次聚類后，共獲得48 894個基因序列，平均長度為 816 bp。表2，表3

T2轉錄組測序共獲得190 704 600個原始序列，經過濾共得到186 196 858個clean reads，GC含量平均為46.58%，Q20和Q30分別平均為96.70%、91.87%。可以看出，此次樣品測序數據可作為后續轉錄本拼接的參考序列。對所獲得的讀序進行拼接得到了154 020個轉錄本，平均長度為798 bp，對轉錄本序列進一步對序列進行層次聚類后，共獲得96 662個基因序列，平均長度為 1 103 bp。表4，表5

T3轉錄組測序共獲得316 287 950個原始序列，經過濾共得到308 085 228個clean reads，GC含量平均為47.11%，Q20和Q30 分別平均為 97.79%、93.67%。此次樣品測序數據質量比較好，可為后續轉錄本拼接作為參考序列。對所獲得的讀序進行拼接得到了180 542個轉錄本，平均長度為1 200 bp，對轉錄本序列進一步對序列進行層次聚類后，共獲得158 918個基因序列，平均長度為 1 326 bp。表6，表7

表2 T1拼接長度分布(bp)Table 2 T1 assembly length distribution statistics

表3 T1拼接長度頻數分布情況Table 3 T1 assembly length frequency distribution statistics

表4 T2拼接長度分布(bp)Table 4 T2 assembly length distribution statistics

表5 T2拼接長度頻數分布情況Table 5 T2 assembly length frequency distribution statistics

表6 T3拼接長度分布(bp)Table 6 T3 assembly length distribution statistics

表7 T3拼接長度頻數分布情況Table 7 T3 assembly length frequency distribution statistics

2.2 病毒相關序列注釋

運用BLAST程序將獲得的轉錄本分別與NCBI的Nr 數據庫和 Swiss Prot 數據庫(http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)進行比對(E-value<10-5)，挑選與植物病毒有同源關系的序列進行分析。

2.2.1 T1轉錄組測序病毒相關序列注釋

對T1測序結果篩選出的66條注釋為植物病毒的基因序列進行分析，發現2種已報道的侵染梨的病毒，分別為ASPV分離物PA66 (txid：651356)、ASGV 分離物P-209(txid：36402)和ASGV 韓國分離物。表5

總共58條基因序列注釋為ASPV。有1條基因序列注釋為ASPV全基因組，序列長度為8 745 bp的comp54214_c0，相似性為81.4%；有41條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的RNA復制相關蛋白，序列平均長度為1 091 bp，比對到RNA依賴的RNA聚合酶基因(RdRp)上相似性最高的序列為comp52223_c0，相似性為99.5%，長度為3 301 bp ;有7條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白和基因沉默蛋白TGBp1，序列平均長度為845 bp，最大長度為1 671 bp的comp53041_c0，相似性為98.7%，比對到運動蛋白和基因沉默蛋白TGBp1上相似性也是最高；有2條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白TGBp2，序列長度為232 bp的comp41062_c0和223 bp的comp29651_c0，相似性分別為100%和95.9%；有7條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的衣殼蛋白，序列平均長度為835 bp，最大長度為 1 490 bp的comp52217_c0，相似性為96.6%，比對到衣殼蛋白基因上相似性也是最高。

總共8條基因序列注釋為ASGV。有3條基因序列注釋為ASGV分離物P-209的基因組多蛋白，序列長度為3 817 bp的comp53314_c2、691 bp的comp352883_c0和236 bp的comp6702_c0，相似性分別為90.5%、93.5%和94.7%；有2條基因序列注釋為ASGV分離物P-209的推定的運動蛋白，序列長度為394 bp的comp6929_c0和202 bp的comp6929_c1，相似性都為100%；有3條基因序列注釋為ASGV韓國分離物的基因組多蛋白，序列長度為280 bp的comp645322_c0、302 bp的comp272030_c0和6 460 bp的comp53 156_c0，相似性分別為94.6%、98.0%和100%。表8

表8 T1候選病毒相關基因序列的注釋Table 8 Summary of annotation results of candidate virus-related gene sequences in T1

2.2.2 T2轉錄組測序病毒相關序列注釋

對T2測序結果篩選出的202條注釋為病毒的基因序列進行分析，發現3種已報道的侵染梨的病毒病毒，分別為ASPV分離物PA66、ASGV 分離物P-209和ASGV 韓國分離物、ACSLV(txid：12175)和一種未報道侵染梨的蕓薹黃化病毒(Brassica yellows virus,BrYV)。

總共185條基因序列注釋為ASPV。有2條基因序列注釋為ASPV全基因組，序列長度為9 294 bp(Cluster-2 341.456 70)和6 255 bp(Cluster-2 341.433 00)，相似性分別為81.7%和97.8%；有127條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的RNA復制相關蛋白，序列平均長度為688 bp，比對到RNA依賴的RNA聚合酶基因上相似性最高的序列為Cluster-2 341.433 00，相似性為89.5%，長度為3 178 bp ;有19條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白和基因沉默蛋白TGBp1，序列平均長度為696 bp，最大長度為2 197 bp的Cluster-2 341.494 09，相似性為98.7%，比對到運動蛋白和基因沉默蛋白TGBp1上相似性也是最高；有13條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白TGBp2，序列平均長度為352 bp，最大長度為621 bp的Cluster-2 341.477 17，相似性分別為98.3%，比對到運動蛋白TGBp2上相似性也是最高；有24條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的衣殼蛋白，序列平均長度為578 bp，最大長度為1 473 bp的Cluster-2 341.472 07，相似性為97.8%，比對到衣殼蛋白基因上相似性也是最高。

總共12條基因序列注釋為ASGV。有2條基因序列注釋為ASGV全基因組上，序列長度為6 519 bp的Cluster-2 341.647 97和5 007 bp的Cluster-2 341.432 63，相似性分別為86.8%和80.4%；有5條基因序列注釋為ASGV分離物P-209的基因組多蛋白，序列平均長度為360 bp，序列最大長度為443 bp的Cluster-2 341.331 23，相似性分別為95.2%，比對到241 kDa的多聚蛋白基因上相似性也是最高；有1條基因序列注釋為ASGV分離物P-209的推定的運動蛋白，序列長度為528 bp的Cluster-2 341.394 14，相似性為100%；有4條基因序列注釋為ASGV韓國分離物的基因組多蛋白，序列平均長度為354 bp，最大長度為435 bp的Cluster-2 341.392 52，似性為80.4%，比對到241 kDa的多聚蛋白基因上相似性最高的序列為Cluster-2 341.331 22，相似性為96.1%，序列長度為388 bp。

總共3條基因序列注釋為ACLSV。有1條基因序列注釋為ACLSV的外殼蛋白，序列長度為930 bp的Cluster-7 440.0，相似性為97.9%；有1條基因序列注釋為ACLSV的RNA多聚酶，序列長度為392 bp的Cluster-12 813.0，相似性為100%；有1條基因序列注釋為ACLSV的推定的運動蛋白，序列長度為1 080 bp的Cluster-2 341.679 88，相似性為98.2%。

總共2條基因序列注釋為蕓薹黃化病毒。有1條基因序列注釋為蕓薹黃化病毒的CP通讀蛋白，序列長度為2 576 bp的Cluster-2 341.308 60，相似性為99.7%，E值為0；有1條基因序列注釋為蕓薹黃化病毒的p1蛋白，序列長度為1 298 bp的Cluster-4 524.0，相似性為98.7%，E值為0。表9

2.2.3 T3轉錄組測序病毒相關序列注釋

對T3測序結果篩選出的921條注釋為病毒的基因序列進行分析，發現2種已報道的侵染梨的病毒，分別為ASPV分離物PA66、ASGV 分離物P-209和ASGV 韓國分離物。

總共有775條基因序列注釋為ASPV。有556條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的RNA復制相關蛋白，序列平均長度為 480 bp，最大長度為3 490 bp的Cluster-9 706.344 28，相似性為93.8%，比對到RNA依賴的RNA聚合酶基因上相似性最高的序列為Cluster-9 706.376 65，相似性為95.5%，長度為2 009 bp ; 有116條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的衣殼蛋白，序列平均長度為475 bp，最大長度為 2 051 bp的Cluster-9 706.763 78，相似性為97.3%，比對到衣殼蛋白基因上相似性也是最高; 有66條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白和基因沉默蛋白TGBp1，序列平均長度為460 bp，最大長度為 1 418 bp的Cluster-9 706.541 41，相似性為97.3%，比對到運動蛋白和基因沉默蛋白TGBp1上相似性最高的序列為Cluster-9 706.766 44，相似性為99.5%，長度為1 111 bp；有22條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白TGBp2，序列平均長度為557 bp，最大長度為 869 bp的Cluster-970 6.763 77，相似性分別為94.2%，比對到運動蛋白TGBp2上相似性最高的序列為Cluster-9 706.763 1，相似性為98.3%，長度為611 bp；有15條基因序列注釋為ASPV分離物PA66的運動蛋白TGBp3，序列平均長度為407 bp，最大長度為 646 bp的Cluster-9 706.632 28和Cluster-9 706.632 29，相似性分別為98.6%、97.1%，比對到運動蛋白TGBp3上相似性最高的序列為Cluster-9 706.763 2，相似性為100%，長度為253 bp。

表9 T2候選病毒相關基因序列的注釋結Table 9 Summary of annotation results of candidate virus-related gene sequences in T2

總共有146條基因序列注釋為ASGV。有118條基因序列注釋為ASGV分離物P-209的基因組多蛋白，序列平均長度為995 bp，最大長度為 5 419 bp的Cluster-9 706.428 9，相似性分別為82.3%，比對到241 kDa的多聚蛋白基因上相似性最高的序列為Cluster-9 706.129 673，相似性為92.8%，長度為3 331 bp；有11條基因序列注釋為ASGV分離物P-209的推定的運動蛋白，序列平均長度為837 bp，最大長度為 1 130 bp的Cluster-9 706.129 564，相似性分別為96.5%，比對到36 kDa蛋白基因上相似性最高的序列為Cluster-9 706.127 953，相似性為96.6%，長度為1 088 bp；有17條基因序列注釋為ASGV韓國分離物的基因組多蛋白，序列平均長度為403 bp，最大長度為727 bp的Cluster-9 706.128 358，相似性分別為98.5%，同時也是比對到241 kDa的多聚蛋白基因上相似性最高的序列。表10

2.3 RT-PCR驗證

針對注釋獲得的ASPV、ASGV、ACLSV 和BrYV 4 種病毒序列，設計特異引物進行 RT-PCR擴增驗證。用所提取的RNA進行反轉錄的cDNA為模板，經過PCR擴增，ASPV、ASGV 2 種病毒序列均能擴增出預期大小的目的條帶。ACLSV和BrYV病毒基因序列均未能擴增出目標條帶。圖1

表10 T3候選病毒相關基因序列的注釋結果匯總Table 10 Summary of annotation results of candidate virus-related gene sequences in T3

注：M：Maker Ⅰ， 1-3：蘋果莖溝病毒的擴增條帶； 4-6：蘋果莖痘病毒的擴增條帶

3 討 論

ASPV、ASGV和ACLSV可危害多種果樹，在大多數梨樹中呈潛伏侵染和混合侵染，多數品種上不表現明顯癥狀，早期多采用指示植物進行鑒定。隨著果樹病毒分離提純技術的提高，制備出部分病毒特異抗血清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)對梨病毒進行快速檢測[28]。近年來，分子生物學檢測技術的快速發展，使果樹病毒檢測效率高、操作簡便、特異性強。與傳統的血清學、分子生物學和生物學病毒檢測方法相比，高通量測序技術在果樹病毒診斷和特定病毒檢測方面具有許多優勢。一是不需要對被感染植物樣本的病毒病原體有預先的知識經驗，例如用PCR檢測法要知道目標病毒種類的基因序列，以便設計用于其分子檢測的引物，或者用ELISA檢測法要制備用于血清學檢測的特異性抗體。除了生物學檢測法，經典的病毒檢測方法具有高度特異性，無法識別可能與植物病害病因有關的未知病毒。高通量測序技術的應用減少了識別病毒病原所需的大量時間，該方法可識別植物的病毒基因組，還可能發現新的病毒病原體的存在。

試驗利用高通量測序技術轉錄組分析庫爾勒香梨中病毒的種類，通過分析三組轉錄組測序數據，獲得了ASPV、ASGV、ACLSV和BrYV 4 種病毒核酸序列，并且獲得了ASPV、ASGV的全基因組。用RT-PCR 技術對轉錄組測序數據進行驗證時發現，只檢測出了ASPV、ASGV這2種病毒。對每種病毒的基因序列數量進行統計，能在一定程度上反映每種病毒的相對含量，可以看出ASPV、ASGV這2種病毒在庫爾勒香梨植株內含量比較高，并且在三組測序數據中都含有這2種病毒，也能反映出庫爾勒香梨被ASPV、ASGV侵染比較普遍。ACLSV和BrYV根據設計的特異性引物都沒有擴增出目標條帶。被注釋為ACLSV的3條基因序列比對到已知的ACLSV的不同蛋白基因上相似性都非常高，RT-PCR技術沒有檢測到可能是因為其含量太低，或者用于RT-PCR驗證的材料中不帶此病毒。BrYV屬于馬鈴薯卷葉病毒屬黃癥病毒科單鏈RNA病毒，含有6個ORFs，試驗獲得的1條BrYV基因序列與已知的BrYV的CP通讀蛋白基因相似性高達99.7%，通讀蛋白與介體傳毒和病毒韌皮部局限特性相關[29]；另一條注釋為BrYV基因序列與已知的BrYV的p1蛋白相似性也很高，此蛋白與病毒復制相關[29]。庫爾勒香梨中是否攜帶BrYV尚有待進一步研究。

高通量測序技術可以鑒定混合樣品病毒變異的基因型以及同一植株體內病毒的不同分離物的快速檢測方法，試驗檢測出了ASGV分離物P-209和ASGV韓國分離物，利用該技術將促進不同病毒或病毒基因型之間相互作用的研究，揭示病毒發病和發展機制。高通量測序技術應用于病毒檢測重要部分之一是測序數據的生物信息學分析，這一步驟在很大程度上依賴于與已知病毒的同源性識別。因此，公共數據庫中公布的越來越多的病毒基因組序列是高通量測序技術用于病毒檢測成功診斷的一個關鍵因素。NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)現已公布超過3 500種病毒(和類病毒)基因組參考序列，綜合植物病原學基因組資源數據庫有623種植物病毒基因組[30]，提高了高通量測序數據與病毒序列的識別，促進植物病毒研究的發展進程。

4 結 論

利用庫爾勒香梨花朵三組的轉錄組測序數據，分別對篩選出注釋為來源于植物病毒的66條、202條、921條基因序列進行分析。三組的轉錄組測序數據均檢測注釋到了蘋果莖痘病毒、蘋果莖溝病毒的大量病毒序列，注釋到了3條蘋果褪綠葉斑病毒的部分序列和2條蕓薹黃化病毒的序列，并且與已知病毒序列相似性非常高。針對注釋獲得的ASPV、ASGV、ACLSV 和BrYV 4 種病毒序列，利用RT-PCR檢測隨機采集的庫爾勒香梨枝條樣品，均擴增出蘋果莖痘病毒和蘋果莖溝病毒的特異條帶，沒有擴增出蘋果褪綠葉斑病毒和蕓薹黃化病毒的特異條帶。