真武湯在縮窄性心包炎患者圍術期應用價值及其機制研究

鐘方明 楊 俊 朱鵬飛 陳 達

縮窄性心包炎常因心包慢性炎癥導致心包增厚、粘連甚至鈣化，致使心功能惡化，長期臨床預后不良，一經確診應盡早進行縮窄心包的剝脫與切除[1-2]。目前臨床常規采取術前積極糾正低蛋白血癥、利尿消腫、胸腹腔引流等措施改善圍術期心功能，但臨床療效有限，且易誘發水電解質紊亂。真武湯出自張仲景《傷寒論》，有溫陽化氣利水之功，可有效改善心衰證候。研究證實，真武湯及其衍生組方能通過減輕心肌纖維化、肥大等病理性組織重塑，改善心功能[3-4]。本研究探討真武湯在縮窄性心包炎圍手術期的治療效果，初步研究其抑制心包組織纖維化改善心功能的具體機制，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 納入2013 年9 月—2018 年12 月期間于浙江省中西醫結合醫院胸外科住院治療并確診為縮窄性心包炎患者80 例，中醫辨證分型為陽虛水泛證，按隨機數字表法分為對照組和真武湯組，每組40 例。本研究方案經我院倫理委員會審核通過，符合《赫爾辛基宣言》相關要求，與所有受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 縮窄性心包炎診斷參考2004 年歐洲心臟病學會制訂的心包疾病診斷與治療指南[5]；中醫辨證分型標準參照第2 版《中醫診斷學》[6]。

1.3 納入、排除標準 納入標準：（1）符合縮窄性心包炎西醫診斷及陽虛水泛證中醫辨證分型標準者；（2）心功能Ⅱ～Ⅲ級；（3）年齡＜75 歲；（4）受試者自愿配合，依從性好。排除標準：（1）合并其他嚴重器質性疾病者；（2）合并有意識障礙或精神疾病者。

1.4 藥物及主要試劑 真武湯煎劑（茯苓、白芍、生姜各45g，白術30g，制附子15g，購于杭州華東中藥飲片有限公司），每劑加水煎成200mL。恒溫離心機（上海安亭科學儀器廠制造，型號：TDL－40B）；實時熒光定量PCR 儀ABI7500（美國Applied Biosystems公司）。Human NT Pro-BNP DuoSet ELISA 試劑盒購自美國R&D 公司（批號DY3604-05）。I 型膠原蛋白（Collagen I）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）、彈性蛋白（Elastin）、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物委托上海Sangon 合成。Collagen I 引物序列參數：上游5'-GACCGATGGATTCCAGTTCG-3'，下游5'-TGTGACTCGTGCAGCCATCG-3'；Collagen Ⅲ引物序列參數：上游5'-AGATGTCCTTGATGTGCAGC-3'，下游5'-CCACCAATGTCATAGGGTGC-3'；Elastin 引物序列參數：上游5'-CCTCAAAGCTGGATTCGCTCT-3'，下游5'-GGCAAGGTGGCTATTCCCA-3'；MMP-1 引物序列參數：上游5'-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3'，下游5'-CTGCTTGACCCTCAGAGACC-3'；MMP-2 引物序列參數：上游5'-AGGGCACATCCTATGACAGC-3'，下游5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3'；MMP-9 引物序列參數：上游5'-CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3'，下游5'-GATTTCGACTCTCCACGCATCT-3'；MMP-13 引物序列參數：上游5'-GCTGCCTTCCTCTTCTTGAG-3'，下游5'-TGCTGCATTCTCCTTCAGGA-3'；TIMP-1 引物序列參數：上游5'-TTGGCTGTGAGGAATGCACA-3'，下游5'-TTTTCAGAGCCTTGGAGGAGC-3'；TIMP-2 引物序列參數：上游5'-GCAAGATGCACATCACCC-3'，下游5'-CGTCACTTCTCTTGATGC-3'；GAPDH 引物序列參數：上游5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。磷酸酶抑制劑混合物-1（批號P2850）和二抗（兔）（批號A8257） 購自Sigma-Aldrich 公司；TGF-β1（批號#3709S）、p-Smad2（批號#3108S）、p-Smad3（批號#9520S）一抗均購自Cell'Signaling'Technology 公司；超敏ECL 化學發光試劑盒（NCM'Biotech）購自新賽美生物科技有限公司（批號P10010）。

2 方 法

2.1 治療方法 所有患者均經胸骨正中切口徑路施行心包剝除術，按先左心后右心的順序剝離增厚心包。切開左心前增厚的心包，順序游離心尖、左室前壁和側壁心包并予以切除。心包切除范圍：兩側至膈神經前緣，上至大血管根部，下至膈面及心尖，并松解上下腔靜脈入口瘢痕組織。兩組患者圍手術期治療均予以術后抗感染、抗結核（結核性心包炎患者）、強心利尿、維持電解質平衡及水的負平衡、激素治療及胸腹腔引流等常規方案治療[5]。真武湯組術前1 周在常規治療基礎上加用真武湯，藥物：茯苓、白芍、生姜各45g，白術30g，制附子15g，加水煎煮至200mL，1 天1 劑，分早晚2 次口服，總療程為2 周。

2.2 心功能指標檢測 于術前及術后第8 天晨起時空腹抽取每位患者靜脈血5mL，離心處理4000r/min，8min，取其上清液，置于-18℃恒溫箱中留存。采用ELISA 法分別檢測其血漿NT-proBNP 的水平，并行超聲心動圖檢查兩組治療前后左室舒張末期內徑（LVEDD）和左室收縮末期內徑（LVESD）、左室射血分數（LVEF）。

2.3 病理組織形態學觀察 取存檔的石蠟包埋心包組織標本，保證切片完整、厚度均勻（4～6μm），徹底脫水透明，用中性樹膠封蓋。最后蘇木精液染色后，光鏡下觀察心包組織的病理特征。

2.4 RT-qPCR 檢測相關基因轉錄水平 取新鮮心包組織標本，采用Trizol 法提取總RNA，測OD 值（RNA OD280/OD260 為1.9）。反轉錄（Reverse Transcription，RT）以Takara 公司附帶的產品說明書為標準，合成cDNA。采用SYBR Green I 熒光染料技術進行定量聚合酶鏈式反應（quantitative Polymerase Chain Reactionq，qPCR）。實驗中每個樣本設置3 個復孔，所有原始數據采用LightCycler 96 SW 1.1 軟件進行分析，以GAPDH 作為內部參照。

2.5 Western blot 檢測相關蛋白表達 取液氮凍存的心包組織樣本，研碎后加入RIPA 裂解液，冰上孵育30min，12000rpm 離心后取上清液，BCA 法測定并調整樣本蛋白濃度，加Loading Buffer 95℃變性5min，-20℃保存。取各組樣本10μg 進行上樣，在10% SDS-PAGE 膠中電泳（濃縮膠80V，分離膠120V），并濕轉至PVDF 膜上（300mA 恒流90min），用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入對應一抗（1:1000稀釋），4℃冰箱搖床（轉速40rpm）過夜。TBST 洗滌10min×3 次（轉速80rpm）。然后，加入山羊抗兔二抗孵育2h（1:5000 稀釋），再次以TBST 洗滌10min×3次。最后用超敏ECL 化學發光試劑盒（A:B 液=1：1）顯色，原始圖像采用Imgae J 軟件處理，以GAPDH（1:5000 稀釋）為內部參照，相對灰度值以與GAPDH比值結果表示。

2.6 統計學方法 應用SPSS 22.0 統計軟件進行實驗數據分析。計數資料以例（n）表示，采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（） 表示，兩組間數據比較采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 兩組縮窄性心包炎患者一般資料比較 對照組40 例，男21 例，女19 例；年齡42～75（57.1±5.8）歲；心功能Ⅱ級15 例，Ⅲ級25 例；病程4～16（8.8±4.3）年。真武湯組40 例，男18 例，女22 例；年齡46～75（58.6±5.2）歲；心功能Ⅱ級14 例，Ⅲ級26 例；病程3～14（7.9±3.2）年。兩組患者基線資料，包括性別、年齡、心功能分級以及病程方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.2 兩組縮窄性心包炎患者血漿NT-proBNP 以及心功能指標比較 兩組患者行心包剝除術前血漿NT-proBNP 以及心功能指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而心包剝除術后，兩組血漿NT-proBNP及心功能指標均有所改善，且真武湯組患者比較對照組血漿NT-proBNP、LVEDD、LVESD 水平有所降低，LVEF 則顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

3.3 兩組縮窄性心包炎患者心包組織病理 對照組心包組織中膠原纖維含量增多、玻璃樣變性，且有明顯鈣化；真武湯組膠原纖維含量降低，玻璃樣變性程度相對減輕。見插頁圖1。

圖1 兩組縮窄性心包炎患者心包組織病理變化（HE 染色400×）

3.4 兩組縮窄性心包炎患者心包組織纖維化相關基因轉錄水平比較 RT-qPCR 表明真武湯組心包組織Collagen I 和Collagen Ⅲ表達量較對照組有所降低，Elastin 表達量相對增高（P＜0.05）。且比較于對照組，真武湯組患者心包組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 轉錄水平以及MMP-2/TIMP-2 和MMP-9/TIMP-1 比率明顯降低，MMP-1 和MMP-13 轉錄水平及MMP-1/TIMP-1 和MMP-13/TIMP-1 比率均顯著增高，兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3.5 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達水平比較 Western blot 顯示，真武湯組心包新鮮標本提取物TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達量較對照組顯著降低，見表3、插頁圖2。

表1 兩組縮窄性心包炎患者血漿NT-proBNP 以及心功能指標比較（）

表1 兩組縮窄性心包炎患者血漿NT-proBNP 以及心功能指標比較（）

注：對照組給予常規方案治療；真武湯組常規治療基礎上加真武湯治療；NT-proBNP 為N 末端腦鈉肽；LVEDD 為左室舒張末期內徑；LVESD 為左室收縮末期內徑；LVEF 為左室射血分數；與本組治療前比較，aP＜0.05；與對照組同期比較，bP＜0.05

表2 兩組縮窄性心包炎患者心包組織纖維化相關基因轉錄水平比較（）

表2 兩組縮窄性心包炎患者心包組織纖維化相關基因轉錄水平比較（）

注：對照組給予常規方案治療；真武湯組常規治療基礎上加真武湯治療；Collagen I 為I 型膠原蛋白；Collagen Ⅲ為Ⅲ型膠原蛋白；Elastin 為彈性蛋白；MMP-1 為基質金屬蛋白酶-1；MMP-2 為基質金屬蛋白酶-2；MMP-9 為基質金屬蛋白酶-9；MMP-13 為基質金屬蛋白酶-13；TIMP-1為基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1；TIMP-2 為基質金屬蛋白酶組織抑制因子-2；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；GAPDH 作為內參，結果以mRNA/GAPDH 比率表示；與對照組比較，aP＜0.05

圖2 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達

表3 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達水平比較（）

表3 兩組縮窄性心包炎患者心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表達水平比較（）

注：對照組給予常規方案治療；真武湯組常規治療基礎上加真武湯治療；TGF-β1 為轉化生長因子-β1；p-Smad2 為磷酸化Smad 蛋白2；p-Smad3 為磷酸化Smad 蛋白3；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與對照組比較，aP＜0.05

4 討論

真武湯在臨床上常用于治療陽虛水泛證候，臨床及動物實驗證實，真武湯及其衍生組方具有強心、利尿、減輕心肌纖維化、消除自由基、改善心功能等療效[7-8]。本實驗將真武湯應用于縮窄性心包炎圍術期的聯合治療，結果表明，真武湯組患者NT-proBNP及LVEDD、LVESD、LVEF 等心功能指標較對照組明顯改善（P＜0.05），其臨床療效得到證實。有文獻顯示，縮窄性心包炎發病基礎是病理性組織重塑，表現為纖維組織增生、玻璃樣變性、炎細胞浸潤、心包鈣化等[9]。亦有研究證實，纖維化是心包縮窄的始發因素，其病理特征主要表現為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的增加，包括Collagen、Elastin、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等[10]。本實驗中，HE 染色顯示縮窄性心包炎患者心包組織膠原纖維含量增多、彈性纖維減少，并出現纖維斷裂、玻璃樣變性等組織重塑特征，而真武湯組心包組織纖維化程度有所減輕，提示真武湯可能改善心包組織纖維化。

心包組織纖維化的直接原因是由基質金屬蛋白酶（MMPs）和基質金屬蛋白酶抑制物（TIMPs）失衡介導的ECM 平衡失調。MMPs 是一組結構相關的細胞外鋅內切肽酶，已知它們能夠切割ECM 的多種成分[11]，可促進纖維膠原降解，能被特定的TIMPs 所抑制[12]。MMPs/TIMPs 比例異常降低將導致ECM 組分合成和沉積增加，降解減少，MMPs 被認為是病理條件下組織重構的關鍵因素。而TIMPs 是一種特異的內源性抑制劑，對MMPs 的活動進行嚴格調控，防止基質過度退化[13]。其中MMP-2，MMP-9 又稱Ⅳ型膠原酶，可增加Collagen/Elastin 比率，引起ECM 沉積；而MMP-1，MMP-8，MMP-13 具有抗纖維化作用，有研究證實其過表達可抑制膠原沉積，改善組織纖維化[14]。這與我們的實驗結果一致，本實驗RT-qPCR驗證真武湯組心包組織Collagen I 和Collagen Ⅲ表達量較對照組有所降低，而Elastin 表達量相對增高（P＜0.05）。另外比較于對照組，真武湯組心包組織MMP-2/TIMP-2 和MMP-9/TIMP-1 的比值有所降低，MMP-1/TIMP-1 和MMP-13/TIMP-1 的比值顯著增高（P＜0.05），表明真武湯可有效調節纖維化相關基因的轉錄水平。

轉化生長因子-β（TGF-β）是ECM 成分表達和纖維化發展的主要調節因子，其中TGF-β1 是心臟成纖維細胞活化和纖維化的重要介質[15-16]。相關研究顯示，在不同類型心包炎患者心包液和血漿轉化生長因子-β1 水平的升高與膠原合成增加有關[17-18]。在經典的TGFβ 信號通路中（Smad 依賴性），TGF-β 信號主要由Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體介導[19]，TGFβ 受體的活化導致Smad2/3（即TGF-β 亞家族的Receptor-regulated Smad，R-Smad）的磷酸化。隨后活化的R-Smad 與Co-mediator Smad（Co-Smad，即Smad4）形成異構體并轉移到細胞核中，進一步調節靶基因的表達[20-21]。本研究Western blot 證實真武湯組心包組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 水平較對照組有所降低，表明真武湯可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路調節下游纖維化相關基因表達水平改善心包纖維化。

綜上所述，真武湯可能通過下調TGF-β1/Smads信號通路調節MMPs/TIMPs 平衡，阻止ECM 沉積，抑制心包組織纖維化，從而改善縮窄性心包炎患者的圍術期心功能。