隱球菌耐藥機(jī)制及抗菌藥物研究進(jìn)展

羅海海，盧才菊，張 偉，徐新平

隱球菌是擔(dān)子菌類酵母真菌微生物，在自然界分布廣泛，作為環(huán)境真菌，同時(shí)又是重要的病原真菌之一，能夠?qū)е码[球菌性腦膜炎和肺炎[1]。隱球菌普遍存在于環(huán)境中，包括相關(guān)的樹木、土壤和鳥糞等，并通過呼吸道進(jìn)入人體。環(huán)境中的干燥隱球菌酵母或孢子通過呼吸道被吸入人體肺部，首先接觸肺巨噬細(xì)胞，被其吞噬，被吞噬的隱球菌通常在巨噬細(xì)胞內(nèi)以休眠狀態(tài)下潛伏[2]，此時(shí)處于定植狀態(tài)，不會(huì)導(dǎo)致肺部感染。當(dāng)宿主免疫力低下時(shí)，隱球菌可以再次活化，在肺部進(jìn)行繁殖，造成肺組織損傷，從而引起肺部感染[3]，如果沒有得到及時(shí)的抗真菌治療，隱球菌可從肺部通過血液循環(huán)傳播到其他器官，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎，并最終導(dǎo)致宿主死亡[4]。隱球菌腦膜炎是隱球菌病最主要的致死原因。據(jù)估計(jì)，每年有100余萬例隱球菌腦膜炎患者，其中60余萬例在診斷后3個(gè)月內(nèi)死亡[4]。隱球菌感染主要發(fā)生在免疫功能嚴(yán)重低下的患者，例如HIV/AIDS患者，接受化療的血液病患者和器官移植后接受免疫抑制治療的患者等[5]。在我國(guó), 也有過免疫正常人群中發(fā)生隱球菌感染的報(bào)道[6]。這些年來，隱球菌感染因?yàn)榫邆淞己玫乃幬锩舾行缘玫揭欢ǔ潭瓤刂疲蚱浏煶涕L(zhǎng)、不良反應(yīng)多、病死率高等特點(diǎn)，仍被全世界高度關(guān)注。臨床上有陸續(xù)分離到耐藥菌株的報(bào)道，另外臨床發(fā)現(xiàn)，二次用藥后容易產(chǎn)生高耐藥菌株，這些均給隱球菌感染的治療帶來隱患。本文將從隱球菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展和隱球菌藥物研發(fā)等方面進(jìn)行綜述。

1 隱球菌耐藥機(jī)制

耐藥性的演變是一種古老而普遍存在的現(xiàn)象，因?yàn)槲⑸镄枰m應(yīng)自然環(huán)境中的惡劣條件并努力生存[7-8]。首先需要明確耐受性與耐藥性的定義。在物種水平上，真菌在暴露于藥物誘導(dǎo)的應(yīng)激過程中其固有的增殖能力不同，這通常被稱為耐受性，與獲得特定的適應(yīng)性突變無關(guān)[9-11]。在群體水平上，真菌可以獲得抵抗藥物作用的特定突變，這被稱為耐藥性。耐受性與生俱來，且微生物種類不同，暴露于藥物不同，其耐受性不同[12]。這里主要探討隱球菌的耐藥性以及相關(guān)分子機(jī)制。抗菌素耐藥性演變的典型機(jī)制是藥物靶點(diǎn)的改變、藥物在細(xì)胞內(nèi)積累的減少或細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)通路的激活等。臨床上耐藥菌株的產(chǎn)生機(jī)制除了單一因素，更多的時(shí)候是多因素共同促進(jìn)產(chǎn)生的[12]。作為致病率和致死率皆為最高的致病真菌，隱球菌產(chǎn)生耐藥性主要有以下幾種情況。

1.1藥物靶基因突變或過表達(dá) 在微生物進(jìn)化過程中耐藥性的最常見機(jī)制之一是通過藥物靶基因突變降低藥物結(jié)合率以及藥物功效[12]。無論是臨床菌株收集還是體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均表明隨著時(shí)間的推移，耐藥性逐漸增加，因?yàn)樵絹碓蕉嗟目剐酝蛔兎e累，從而逐漸產(chǎn)生耐藥性[13]。在環(huán)境壓力的選擇下，只有那些發(fā)生了對(duì)生存有利的突變的隱球菌菌株才能夠生存下來。Erg11/CYP51是麥角固醇生物合成重要的細(xì)胞色素P450(CYP450)家族中的單加氧酶，是唑類抗生素結(jié)合的主要靶標(biāo)蛋白，一旦結(jié)合唑類抗生素(比如氟康唑)，能夠阻斷麥角固醇合成，選擇性抑制甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)，可導(dǎo)致麥角甾醇耗竭，羊角甾醇和其他14-甲基甾醇積累，從而抑制真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)ERG11基因發(fā)生關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)突變，致使唑類抗生素?zé)o法與其結(jié)合，從而導(dǎo)致新型隱球菌對(duì)唑類藥物產(chǎn)生抗性。有研究表明氟康唑是通過與血紅素基鐵形成配位鍵結(jié)合CYP51的活性位點(diǎn)而發(fā)揮作用[15]，然而G484S氨基酸替換與氟康唑抗性有關(guān)，可能對(duì)血紅素環(huán)境的構(gòu)象發(fā)生改變從而影響氟康唑結(jié)合[16]。先前有研究者分離出臨床耐藥菌株MRL862，通過比較基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5個(gè)錯(cuò)義突變可能參與氟康唑耐藥性，其中之一是在Erg11/Cyp51催化結(jié)構(gòu)域苯丙氨酸取代氨基酸145(Y145F)[17]。通過進(jìn)一步驗(yàn)證，該突變確實(shí)參與耐藥性形成，并且對(duì)不同唑類表現(xiàn)不同敏感性。在白色念珠菌[18]和煙曲霉菌[19-20]中也報(bào)道了Erg11/Cyp51中的其他錯(cuò)義突變，導(dǎo)致對(duì)不同的唑類的敏感性不同。對(duì)此，深入研究發(fā)現(xiàn)Erg11/Cyp51的多個(gè)氨基酸殘基可能影響酶與唑類的相互作用，導(dǎo)致該突變對(duì)不同唑類表現(xiàn)不同敏感性[17]。除了藥物靶標(biāo)基因突變，藥物靶標(biāo)基因的表達(dá)量的增加也可以導(dǎo)致抗性。在新型隱球菌中，ERG11的表達(dá)受不同的類似于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)的控制，例如轉(zhuǎn)錄因子Sre1，在響應(yīng)唑類應(yīng)激時(shí)，會(huì)增加ERG11表達(dá)，從而導(dǎo)致抗性[21-22]。

1.2減少細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積 微生物進(jìn)化出耐藥性的另一種方式是通過激活外排泵來減少細(xì)胞內(nèi)藥物的蓄積。新型隱球菌中發(fā)揮藥物轉(zhuǎn)運(yùn)作用的是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族(ATP-binding cassette superfamily)，主要包括AFR1、AFR2和Mdr1，3個(gè)基因的表達(dá)由應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子獨(dú)立調(diào)節(jié)，其中AFR1是唑類主要外排泵，其編碼的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已經(jīng)被證實(shí)和增加新型隱球菌對(duì)唑類耐藥性水平有關(guān)[23-25]，AFR2和Mdr1起著協(xié)助AFR1的外排作用，但作用較小，目前三者具體作用機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，Afr1，Afr2和Mdr1在對(duì)兩性霉素B、5-氟胞嘧啶和棘白菌素的敏感性中似乎沒有明顯作用[8]。除了增加外排，微生物也可通過減少藥物輸入來減少細(xì)胞內(nèi)藥物積累。有研究發(fā)現(xiàn)，在新型隱球菌中，唑類藥物通過與能量無關(guān)的擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)出細(xì)胞[26]，這方面的研究還有待于探索。

1.3應(yīng)激反應(yīng)通路的調(diào)節(jié) 微生物配備了復(fù)雜的通路，可以應(yīng)對(duì)細(xì)胞外各種壓力因子的刺激，其中各類抗真菌藥物就是重要的壓力因子[9-11]。分子伴侶蛋白HSP90是細(xì)胞通路中實(shí)現(xiàn)對(duì)抗真菌藥物的一個(gè)關(guān)鍵樞紐，它是所有真核生物中必不可少的伴侶蛋白，可通過脫乙酰作用于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶等，通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶控制應(yīng)激反應(yīng)，包括耐藥性，同時(shí)還可調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有深遠(yuǎn)影響的各種靶蛋白的活性[27-28]。研究表明，HSP90可以增加宿主中新型隱球菌對(duì)唑類和棘白菌素的抗性[29]。其他調(diào)節(jié)因子例如雷帕霉素蛋白激酶的靶標(biāo)(TOR)，其控制細(xì)胞對(duì)可用營(yíng)養(yǎng)物變化的反應(yīng)[30-31]，雷帕霉素可通過對(duì)抑制TOR功能從而抑制多種真菌的生長(zhǎng)，包括新型隱球菌[32-33]。

1.4通過改變?nèi)旧w數(shù)量或基因組拷貝數(shù)獲得耐藥性—基因組的可塑性 真菌物種能夠適應(yīng)各種環(huán)境變化，部分原因在于其基因組的可塑性，特別是非整倍體，越來越被認(rèn)為是細(xì)菌和致病性真核生物的適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)[34]。也就是說，真菌可通過非整倍體的獲得，促進(jìn)對(duì)抗真菌藥物的耐藥性的產(chǎn)生[12]。研究發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物可誘發(fā)隱球菌產(chǎn)生類似細(xì)胞凋亡過程的細(xì)胞死亡，剔除隱球菌凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)可促進(jìn)染色體多倍體的形成，主要是非整倍體，從而對(duì)氟康唑產(chǎn)生耐藥性[35]。也有研究表明，新型隱球菌可以通過下調(diào) AIF表達(dá)，引起1號(hào)染色體(Chr1)復(fù)制獲得非整倍體，從而適應(yīng)高濃度的氟康唑[24]。因?yàn)槌砂偕锨€(gè)基因存在于每條染色體上，而Chr1拷貝數(shù)的增加，會(huì)導(dǎo)致基因的額外表達(dá)，可能在面對(duì)各種不同的壓力時(shí)提供應(yīng)激選擇性優(yōu)勢(shì)[36]。也有研究證實(shí)，隱球菌對(duì)氟康唑的耐藥性是一種瞬時(shí)適應(yīng)性抗性，這種抗性在藥物壓力釋放下喪失[37-38]，并且這種抗性與非整倍性染色體有關(guān)，但與白色念珠菌等其他酵母不同，新型隱球菌抗性菌落來自單核的細(xì)胞而不涉及多核/多聚體階段，非整倍體也非來自多核細(xì)胞和染色體錯(cuò)誤分離[37]。新型隱球菌還被證明能形成Titan細(xì)胞-大型多倍體細(xì)胞，通過逃避免疫逃逸和宿主傳播而避免吞噬，從而對(duì)隱球菌的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生重大影響[39-40]。研究發(fā)現(xiàn)，在接觸氟康唑時(shí)，Titan細(xì)胞似乎會(huì)產(chǎn)生對(duì)氟康唑耐藥的非整倍體子代細(xì)胞[40]。

1.5真菌耐藥性的表觀遺傳機(jī)制 表觀遺傳學(xué)是指由DNA序列修飾以外的因素介導(dǎo)的細(xì)胞變化，這些變化不改變DNA序列或蛋白質(zhì)編碼，而是瞬間影響目標(biāo)基因的表達(dá)[41]。表觀遺傳修飾主要分為兩種機(jī)制：基于RNA的和基于染色質(zhì)的修飾[41]。基于RNA的修飾：表觀突變和通過長(zhǎng)的非編碼RNA(lncRNA)指導(dǎo)的染色質(zhì)沉默[41]。真菌中的表觀突變被發(fā)現(xiàn)是賦予抗真菌劑FK506和雷帕霉素耐藥性的一種機(jī)制[42]。這兩種藥物都與肽基脯氨酰異構(gòu)酶FKBP12結(jié)合，然后分別抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和TOR。通過由FKBP12的編碼基因fkbA的突變或缺失誘導(dǎo)抗性，發(fā)現(xiàn)這些菌株的表觀突變是瞬時(shí)的和可逆的。在沒有抗真菌暴露的培養(yǎng)基上經(jīng)過數(shù)次傳代后，表觀突變株不再產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于fkbA的sRNA，并恢復(fù)為藥物敏感性的野生型水平[41]。lncRNA指導(dǎo)的染色質(zhì)沉默主要在粟酒裂殖酵母中研究較多，其中ncRNA.1343(lncRNA)的刪除導(dǎo)致對(duì)多種藥物超敏，研究發(fā)現(xiàn)ncRNA.1343控制著鄰近的tgp1基因，該基因編碼甘油磷酸二酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1。ncRNA.1343增加了核小體密度，從而限制了tgp1基因轉(zhuǎn)錄的途徑。因此，當(dāng)ncRNA.1343的缺失誘導(dǎo)tgp1表達(dá)時(shí)，lncRNA通過轉(zhuǎn)錄干擾來調(diào)節(jié)藥物抗性，從而使細(xì)胞對(duì)藥物敏感[43]。基于染色質(zhì)的修飾：化學(xué)或結(jié)構(gòu)上改變?nèi)旧|(zhì)[44-45]。化學(xué)修飾包括組蛋白和DNA的翻譯后修飾：烷基化(甲基化和乙酰化)、磷酸化、泛素化和磺酰基化等[41]。而結(jié)構(gòu)修飾包括染色質(zhì)重塑和DNA-DNA相互作用[41]。目前已知參與去乙酰化過程的基因有HDA1和RPD3。新型隱球菌中HDAC基因的缺失導(dǎo)致致病性降低以及對(duì)多種壓力敏感[46]。HDAC之一Hda1被證明是可以調(diào)節(jié)毒力和壓力適應(yīng)所需的基因[41]。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾例如白色念珠菌的Swi/Snf染色質(zhì)重塑復(fù)合物，作為Mrr1的激活因子，而Mrr1是增強(qiáng)藥物外排泵Mdr1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，最終通過改變Mdr1表達(dá)增強(qiáng)對(duì)氟康唑耐藥性[47]。

1.6異質(zhì)性耐藥 微生物耐藥的一種特殊類型,其特征在于在易感菌株的單個(gè)菌落內(nèi)出現(xiàn)較小的亞群，其可以耐受高于菌株MIC(最低抑菌濃度)的抗菌藥物濃度，甚至高度耐藥，然而，通過在不含藥物培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這種獲得性抗性就會(huì)喪失，并且菌株恢復(fù)到其原始MIC[37-38]。這部分耐藥亞群可以導(dǎo)致臨床應(yīng)用抗菌藥物的失敗。1999年，在體外首次觀察到了新型隱球菌菌對(duì)氟康唑的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[48]，在格特隱球菌中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象[49]。在新型隱球菌中，單細(xì)胞能夠產(chǎn)生具有異質(zhì)性抗性表型的后代，后代中有很少一部分的子集會(huì)一直對(duì)唑類具有高度抗性[38]，這種現(xiàn)象使菌群能夠適應(yīng)逐步增加的唑類濃度。在新型隱球菌中控制這種反應(yīng)的分子機(jī)制涉及CHr1非整倍體的形成，其染色體上含有唑類靶標(biāo)ERG11和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AFR1的基因[50]，可能對(duì)上述基因產(chǎn)生影響而發(fā)揮作用。異質(zhì)性耐藥主要出現(xiàn)在唑類單藥治療過程中，研究表明，氟康唑聯(lián)合5-氟胞嘧啶治療可有效抑制體內(nèi)異抗性亞群的擴(kuò)增[51]。

2 隱球菌抗菌藥物研究

目前，主要的抗真菌藥物有4類：多烯、唑類、嘧啶類似物和棘白菌素(圖1)，抗真菌治療通常采用單一或組合療法[52]。隱球菌引起的肺部感染和腦膜炎的治療首選藥物是氟康唑和兩性霉素B。嘧啶類似物常作為聯(lián)合用藥，單用容易產(chǎn)生耐藥性[53]，而棘白菌素對(duì)隱球菌無效[12]。氟康唑是唑類抗真菌藥物，具有廣譜、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)。其作用機(jī)制是通過抑制真菌細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成途徑中的CYP51從而影響細(xì)胞膜上的麥角固醇代謝，破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致真菌死亡[12]。然而，氟康唑具有抑菌而不是殺菌作用[54]。兩性霉素B是多烯類抗真菌藥物，其作用機(jī)制是選擇性地與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，使膜的通透性增高，引起菌體內(nèi)容物流出，導(dǎo)致真菌死亡[12]。但兩性霉素B由于其宿主毒性，其使用僅限于初始治療[55]。臨床發(fā)現(xiàn)，在較長(zhǎng)的治療過程中，隱球菌對(duì)氟康唑、兩性霉素B會(huì)產(chǎn)生耐藥性，從而使治療失敗[56]。考慮隱球菌感染對(duì)人體身心健康造成嚴(yán)重危害, 并且耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，同時(shí)臨床可用藥物少，抗真菌藥物的宿主毒性，以及治療療程長(zhǎng)，目前迫切需要深入研究新型抗隱球菌藥物，以期獲得治療隱球菌感染的新方法。

圖1 主要抗真菌藥物的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of polyenes, azoles, pyrimidine analogs, and echinocandins

2.1胺碘酮、甲硫噠嗪和芬地林 Krysan、Hall等[57]利用高通量藥物篩選技術(shù)(high-throughput screening，HTS),篩選了專利過期藥物庫(kù)以及化合物庫(kù), 發(fā)現(xiàn)了36個(gè)能夠抗隱球菌的藥物。研究發(fā)現(xiàn)胺碘酮、甲硫噠嗪和芬地林均具有殺死隱球菌的活性[57-59]。碘胺酮是臨床常用抗心律失常藥, 具有輕度非競(jìng)爭(zhēng)性地阻滯α、β腎上腺素受體作用，甲硫噠嗪是吩噻嗪類哌啶族抗精神失常藥物，作用于中樞及植物神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)，具有阻滯α、M及DA等受體作用，胺碘酮和甲硫噠嗪可能是通過拮抗鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶發(fā)揮殺菌作用[59]。芬地林是L型鈣離子通道阻滯劑，其自身并無抗隱球菌活性, 但其可促使吞噬體酸化，間接發(fā)揮殺菌作用[58]。

2.2舍曲林 多個(gè)科研小組通過HTS篩選抗隱球菌藥物, 均發(fā)現(xiàn)了舍曲林的良好抗菌活性[57]。舍曲林是5-羥色胺選擇性再攝取抑制劑，治療抑郁癥的常見藥物。研究發(fā)現(xiàn)舍曲林具有殺隱球菌活性, 與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同抗真菌作用，且兩者之間不存在交叉耐藥[60-61]。研究者在狗和大鼠身上進(jìn)行舍曲林的藥代動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果顯示大腦、腦脊液等部位舍曲林的濃度比血清濃度高20至40倍，達(dá)到或超過舍曲林對(duì)隱球菌分離株的MIC[62]，表明舍曲林在治療隱球菌腦膜炎的優(yōu)勢(shì)。此外，有豐富的臨床數(shù)據(jù)支持舍曲林長(zhǎng)期使用的安全性[63-64]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，舍曲林通過靶向膜組織和囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸而發(fā)揮抗隱球菌作用[65-66]。另有研究表明，舍曲林會(huì)抑制翻譯起始，通過破壞真菌的翻譯，從而干擾真菌蛋白質(zhì)合成，最終發(fā)揮抗隱球菌活性[61]。舍曲林已進(jìn)入臨床研究，我們拭目以待。

2.3MMV665943 研究者在篩選抗真菌藥物時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗瘧疾藥物中MMV665943(IUPAC名稱4-[6-[[2-(4-氨基苯基)-3H苯并咪唑-5-基]甲基]-1H-苯并咪唑-2-基]苯胺)具有抗真菌活性。研究表明，MMV665943抗新型隱球菌的活性比氟康唑高16至32倍，同時(shí)對(duì)格特隱球菌和白色念珠菌也有抗真菌作用。目前該藥作用具體機(jī)制尚不明確[67]，可作為潛在靶點(diǎn)繼續(xù)研究。

2.4煙酰胺(NAM) 一種酰胺形式的維生素B3，具有治療線粒體腦病、神經(jīng)退行性疾病、皮膚癌、惡性瘧原蟲、結(jié)核分枝桿菌等的活性。研究發(fā)現(xiàn)NAM有抗新型隱球菌的活性，同時(shí)對(duì)白色念珠菌、非白色念珠菌(包括抗氟康唑念珠菌-光滑念珠菌、克魯斯氏念珠菌)也具有活性。GIN4參與編碼胞裂蛋白(septin)調(diào)控蛋白激酶，其對(duì)于維持細(xì)胞壁完整性至關(guān)重要，研究表明NAM可能通過干擾GIN4，從而影響細(xì)胞壁完整性而發(fā)揮抗真菌活性[68]。NAM可作為潛在靶點(diǎn)，有待于深入研究。

2.5FLC1 黃素腺嘌呤二核苷酸—FAD是參與合成幾種黃酮類化合物的重要輔助因子，例如NADH氧化酶和丙酮酸脫氫酶[69]。黃素載體FLC是FAD的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[70]。研究表明，F(xiàn)LC1在新型隱球菌中發(fā)揮重要作用，例如在JEC21菌株中，F(xiàn)LC1參與維持細(xì)胞壁的完整性，也是新型隱球菌在高溫下生長(zhǎng)所必需的。同時(shí)毒力因子—莢膜和黑色素的生成以及酵母侵襲性生長(zhǎng)均需要FLC1。重要的是體外實(shí)驗(yàn)表明，隱球菌FLC1參與對(duì)兩性霉素B、5-氟胞嘧啶等藥物的耐藥性產(chǎn)生，但與氟康唑的耐藥性沒有很大相關(guān)性[69]。由此可見，真菌特異性黃素載體FLC1可作為治療隱球菌的新靶點(diǎn)。

2.6VT-1129 唑類藥物通過抑制CYP51進(jìn)行抗真菌作用，但也能抑制CYP450，而氟康唑、伏立康唑等唑類藥物都是CYP450的底物，繼而產(chǎn)生毒副作用及影響藥物抗菌活性[71]。研究發(fā)現(xiàn)靶向CYP450是由唑類藥物高親和力的金屬結(jié)合基團(tuán)(MBG)造成的, 因此, 基于伏立康唑合成了一系列低親和力MBG化合物, 其中口服藥物VT-1129, 具有良好的抗隱球菌活性，同時(shí)對(duì)真菌CYP51具有高度特異性[71]，其對(duì)新型隱球菌的MIC50范圍優(yōu)于唑類、多烯類等藥物[72]，并且發(fā)現(xiàn)VT-1129對(duì)氟康唑耐藥的隱球菌也有活性[73]。目前VT-1129擬進(jìn)行臨床研究，有望成為新靶點(diǎn)。

2.7AR-12 乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase，Acs)是新型隱球菌發(fā)揮毒力所必需，在真菌中，Acs以依賴ATP的方式利用乙酸和輔酶A合成CoA[74]，但人體細(xì)胞的Acs主要以依賴ATP的方式利用檸檬酸裂合酶合成CoA[60]。有研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布衍生物AR-12對(duì)酵母、霉菌和雙態(tài)性真菌等均具有良好抗菌活性，且其藥物靶點(diǎn)是Acs[60,75-76]。體外實(shí)驗(yàn)表明AR-12具有良好的抗菌效果, 與氟康唑聯(lián)用能加強(qiáng)對(duì)小鼠隱球菌性腦膜炎的療效, 目前該藥物已在歐洲取得許可, 應(yīng)用于聯(lián)合氟康唑治療隱球菌性腦膜炎[60]。因?yàn)镃oA在真菌生物功能中非常重要, 而在人體細(xì)胞中合成路徑不同,所以Acs成為治療隱球菌新靶點(diǎn)是相當(dāng)有前景的。

2.8PD-1 程序性死亡受體1(PD-1)是一種重要的免疫抑制分子，通過下調(diào)免疫系統(tǒng)對(duì)人體細(xì)胞的反應(yīng)，以及通過抑制T細(xì)胞活化來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并促進(jìn)自身耐受。有研究表明抗PD-1治療促進(jìn)小鼠肺部隱球菌感染的清除。將C57BL/6小鼠感染中等毒力的新型隱球菌，發(fā)現(xiàn)持續(xù)的隱球菌感染會(huì)引起肺等組織中白細(xì)胞數(shù)量增加，包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，同時(shí)會(huì)引起肺極化CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等表達(dá)PD-1增加，肺樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞特異性亞群表達(dá)PD-L1、PD-L2(PD-1配體)增加。研究發(fā)現(xiàn)，通過抗PD-1治療，能有效地提高肺、腦、脾的真菌清除，同時(shí)能明顯降低影響真菌清除的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(IL-5 和IL-10) 的表達(dá)[77]。OX40促進(jìn)記憶T細(xì)胞反應(yīng)，并已被證明可增強(qiáng)新型隱球菌感染小鼠的真菌清除率[78]，抗PD-1治療能明顯升高OX40在CD4+細(xì)胞上的表達(dá)，尤其是Th1、Th17細(xì)胞[77]。PD-1作為抗隱球菌的作用靶點(diǎn)有待深入研究。

2.9他克莫司(FK506) FK506最初作為免疫抑制劑，治療免疫相關(guān)性疾病，然而還表現(xiàn)出潛在的抗真菌活性[79]。FK506通過與靶向免疫親蛋白結(jié)合，然后抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性而發(fā)揮抗真菌作用[80]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506與棘白菌素類藥物聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同抗真菌作用[81]，與氟地西尼(fludioxonil)聯(lián)合使用時(shí)，極大增強(qiáng)了對(duì)新型隱球菌的生長(zhǎng)抑制作用，但單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)隱球菌生長(zhǎng)影響不大，由此可見這兩種藥物具有協(xié)同殺真菌作用，并且已證實(shí)靶標(biāo)是鈣調(diào)磷酸酶[82]。因此FK506可聯(lián)合治療隱球菌感染。

2.10氨基酸通透酶 真菌一旦感染宿主，由于抗真菌劑的高毒性和高獲得性抗性，治療侵襲性真菌感染難度大，特別是隱球菌病[83]。動(dòng)物細(xì)胞中缺乏一些真菌生物合成途徑，其中，色氨酸和甲硫氨酸生物合成途徑已被列為有效靶標(biāo)[83]。研究新型隱球菌中運(yùn)作的氨基酸攝取系統(tǒng)，通過BLAST，以24個(gè)釀酒酵母序列作為參照，我們發(fā)現(xiàn)新型隱球菌基因組編碼10個(gè)APC家族的質(zhì)膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Aap1-8、Mup1、Mup3)以及似乎編碼GABA通透酶的3個(gè)基因(CNAG_01535，CNAG_02455和CNAG_05017)[84-86]。通過NCBI檢索，查詢?nèi)祟愔芯庉嫲被嵬ㄍ该傅幕颍覀儼l(fā)現(xiàn)大多數(shù)新型隱球菌和人類的氨基酸通透酶具有低的同一性和低查詢覆蓋率，不僅在氨基酸一級(jí)序列上存在差異，而且對(duì)于已知具有功能的保守氨基酸殘基也不同，表明具有高選擇性毒性[83]，因此氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有可能作為藥物靶標(biāo)，用于抗真菌治療。

2.11毒力因子 毒力因子相關(guān)組分作為抗隱球菌治療的研究目前不少見。隱球菌毒力因子主要是莢膜和黑色素。甘露糖(MAN)是莢膜的重要組成部分，與鳥苷二磷酸(GDP)結(jié)合，參與糖的生物合成。在新型隱球菌中有2個(gè)GDP-MAN轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Gmtl和Gmt2，均能調(diào)控GDP-MAN向高爾基體的運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Gmtl和Gmt2，對(duì)新型隱球菌的莢膜、糖的生物合成以及毒力均有負(fù)向影響，且對(duì)人類高爾基體沒有影響，因此GDP-MAN轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可作為抗隱球菌治療的潛在靶點(diǎn)。另外參與莢膜組裝的水解酶，參與黑色素合成的真菌漆酶，參與尿素代謝的脲酶等目前均有相關(guān)研究[87]，這里就不逐一列舉。

2.12促進(jìn)形態(tài)轉(zhuǎn)換或直接調(diào)控毒力 最近發(fā)現(xiàn)的氨基葡萄糖可以促進(jìn)隱球菌從酵母形態(tài)向菌絲體轉(zhuǎn)化，酵母形態(tài)是毒力和感染的形態(tài)，而菌絲體狀態(tài)是隱球菌對(duì)宿主無害的狀態(tài)，這個(gè)轉(zhuǎn)化的過程牽涉到毒力從高到低到無的過程，并伴隨毒力因子被抑制的過程[88]。氨基葡萄糖或者類似于這類能夠在隱球菌感染宿主體內(nèi)促進(jìn)隱球菌形態(tài)轉(zhuǎn)換(酵母向菌絲體轉(zhuǎn)化)和毒力因子表達(dá)被抑制從而使得宿主體內(nèi)隱球菌無毒，是否可以作為一種新型藥物進(jìn)行研發(fā)？不直接殺死病菌，使其喪失感染能力，從而與宿主“和諧”相處，這類新型藥物也許還不會(huì)促進(jìn)隱球菌產(chǎn)生“對(duì)抗力”-耐藥性。

3 討 論

全球隱球菌感染每年的死亡率非常高，長(zhǎng)期使用抗真菌藥引起隱球菌耐藥從而導(dǎo)致臨床治療失敗，同時(shí)造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，隱球菌感染對(duì)肝腎等臟器毒副作用明顯，故對(duì)隱球菌相關(guān)耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，同時(shí)闡述可能的抗菌藥物及治療靶點(diǎn)，以期促進(jìn)更有效安全地治療隱球菌感染。目前就現(xiàn)有抗菌藥物而言，聯(lián)合治療不失為抗真菌治療的有效方法，聯(lián)合治療可降低個(gè)體藥物劑量和減少治療療程，使宿主毒性最小化，徹底殺死宿主體內(nèi)的隱球菌，從而避免二次用藥所產(chǎn)生的慣有的耐藥菌。藥物組合有可能通過幾種機(jī)制阻礙耐藥性的演變，兩種藥物聯(lián)合可以產(chǎn)生疊加的殺傷效應(yīng)，減少病原體種群大小，從而減少獲得抗性突變的可能性。另外，每種抗真菌劑具有不同作用機(jī)制，單獨(dú)對(duì)每種藥劑產(chǎn)生耐藥的可能性小于單獨(dú)對(duì)任一藥劑產(chǎn)生耐藥性的可能性。另外，新技術(shù)的應(yīng)用，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的新型的抗真菌藥物。

利益沖突：無