Galectin-1與胃癌細胞阿帕替尼敏感性的關系及調控機制研究

冷嬌，劉雪梅，張匠，毛英，劉黎

（遂寧市中心醫(yī)院 腫瘤科，四川 遂寧 629000）

隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，越來越多的生物學分子被發(fā)現并用于臨床惡性腫瘤的診斷和治療。甲磺酸阿帕替尼（Apatinib）是一種高度特異性靶向抑制血管的內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2）酪氨酸激酶活性的小分子抗血管生成劑[1]。LIN 等[2]學者證實，阿帕替尼可靶向抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）/VEGFR-2 信號通路，從而抑制胃癌細胞的增殖，并促使其凋亡。雖然阿帕替尼在臨床上有理想的應用前景，但是目前仍然缺乏預測或篩選優(yōu)勢人群的生物標志物。半乳糖凝集素1（Galectin-1）是最早發(fā)現的Gal 家族成員，在胃癌[3]、乳腺癌[4]、甲狀腺癌[5]等腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）中呈異常高表達，并且可能與上皮間質轉化有關。SANO 等[6]學者也發(fā)現，Galectin-1 可以通過識別β-半乳糖苷而與內皮細胞表面VEGFR-2 結合，進而不依賴于VEGF 的作用激活下游信號通路，影響抗VEGF/VEGFR-2 藥物治療的敏感性。因此本研究擬通過制備Galectin-1 低表達SGC7901 胃癌細胞模型，分析其對上皮間質轉化分子機制和阿帕替尼敏感性的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人胃癌細胞株SGC-7901 購自上海復旦IBS 細胞資源中心（FuDan IBS Cell Center, FDCC），37℃恒溫水浴迅速融化，1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入1 ml RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸，轉移至細胞培養(yǎng)瓶。使用含10%特級胎牛血清、100 u/ml 青-鏈雙抗的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，設置條件： 37℃、穩(wěn)定5%二氧化碳，95%相對飽和濕度。

1.1.2 主要試劑和儀器甲磺酸阿帕替尼購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，使用前用生理鹽水倍比稀釋至實驗濃度。RPMI 1640 細胞培養(yǎng)基、特級胎牛血清、青-鏈雙抗購自美國Gibco 公司，甲基噻唑基四唑（MTT）、嘌呤霉素、Trizol 試劑、聚凝胺（Polybrene）購自美國Sigma 公司，SuperScript First-Strand Synthesis System 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購自美國Applied Biosystems 公司，鼠抗人上皮型E-cadherin 抗體、鼠抗人Twsit1 抗體、兔抗人Vimentin 抗體、兔抗人Snail 抗體和兔抗人ZEB 抗體購自美國Santa Cruz 公司。委托上海吉瑪公司設計2條干擾Galectin-1 siRNA 序列，1 號正向引物： 5'-AT CGGGATCCGGGCCTTGGAACTGATGAAtt-3'，反向引物： 5'-GACTCTATCGGAATTCTTCATCAGGCCCtt-3'，長度435 ～452 bp；2 號正向引物： 5'-ATCGGGAT CCGGCCATAATGGTTAAGGTtt-3'，反向引物： 5'-GA CTCTATCGGAATTCACCTTTATATGGCTCtt-3'， 長度375～391 bp。陰性無序序列正向引物： 5'-GGAC TCTTCAGTTTGTAGTAGGGGCAACtt-3'，反向引物： 5'-TGGGAGGTCTTCGAGTTCGGACTGCCCCtt-3'， 長度322 ～363 bp。IX73 熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯光學公司，T100 PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司，通用基礎電泳儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 細胞轉染及分組

構建pSiren 包裹的Galectin-1 干擾pSiren-shRNA逆轉錄病毒載體。取對數期生長的SGC-7901 細胞接種在6 孔板中，分為空白對照組（正常培養(yǎng)，不做任何特殊處理）、陰性siRNA 組（轉染陰性無序序列）、Gal1-siRNA1 組（轉 染Gal1-siRNA1 序 列）、Gal1-siRNA2 組（轉染Gal1-siRNA2 序列），加入Polybrene轉染試劑，同時加入適量pSiren-shRNA 逆轉錄病毒載體懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，更換新鮮培養(yǎng)液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光染色，以判斷感染率。瞬時轉染成功后用1μg/ml 嘌呤霉素篩選2 ～3 周，將耐嘌呤霉素的穩(wěn)轉細胞用于后續(xù)實驗。采用qRTPCR 和Western blotting 驗證細胞轉染效果。篩選有效干擾Galectin-1 表達的siRNA 序列進行后續(xù)研究。

1.3 MTT 法

取SGC-7901 細胞按1×103個/孔單層接種至96 孔板中，每組設置8 個平行孔，每孔加入100μl 梯度濃度增加的阿帕替尼，濃度設置分別為5、25、125和625μmol/L，培養(yǎng)48 h 后，檢測吸光度（Absorbance，A）值。MTT 檢測方法： 每孔加入20μl MTT 試劑，靜置4 h 后輕輕丟棄上清，加入200 ml 二甲基亞砜溶解結晶紫，用酶標儀檢測吸收波長490 nm 處的A 值。計算細胞增殖抑制率： 增殖抑制率（%）=1-A受試組/A對照組×100%。

1.4 細胞增殖活力測定

細胞接種方法同1.3，加入20μmol/L 阿帕替尼，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT 檢測方法參照1.3。

1.5 Annexin V/PI 雙染法

收集25μmol/L 阿帕替尼作用48 h 后的細胞，用PBS 和無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液反復洗滌后，加入1×Binding Buffer 重懸，調整細胞濃度約1×106個/ml，加入5μl Annexin V-FITC 和5μl PI，用300 目篩網過濾，上機檢測細胞凋亡情況。

1.6 DAPI 染色

取SGC-7901 細胞按1×105個/孔單層接種至12 孔板中，加入25μmol/L 阿帕替尼作用48 h，棄上清，加入4%多聚甲醛固定，每孔加入5 ml DAPI 染色液，避光孵育5 min，熒光顯微鏡下拍照計數。

1.7 RNA 提取和qRT-PCR

加入Trizol 試劑提取細胞總RNA。采用Nanodrop 2000 核酸測定儀檢測RNA 濃度和純度，用SuperScript First-Strand Synthesis System 試劑盒逆轉錄生成cDNA，逆轉錄反應條件： 42.0℃、60 min，70.0℃、5 min，40.0℃、2 min。取2μg cDNA 模板、正反向引物各1μl、2×Taq Master Mix 12.5μl，加入適量去離子水，配制25μl PCR 反應體系，按照SYBR DDPeen PCR master Mix 說明書進行qRT-PCR。PCR 反應條件： 95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃（Galectin-1 mRNA）或54.5℃（GAPDH mRNA）退火30 s，72℃延伸25 s，共計40 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。Galectin-1 mRNA 正向引物： 5’-GTATTCGCACTGGATACGACC GACCG-3’，反向引物： 5’-TGCTTTGCTCATGACATG TCTACAGCCCA-3’，引物長度100 bp；GAPDH 正向引 物： 5’-CAGCAATTACCAACGAATGCCGA-3’；反向引物： 5’-GATCTGCGTACCCACACCATGGA-3’，引物長度182 bp。從軟件中讀取到達閾值的循環(huán)數Ct值。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相對表達量。

1.8 Western blotting

加入RIPA 和PMSF 混合細胞裂解液，提取總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣Marker 混合煮沸，進行SDS-PAGE 凝膠電泳。將蛋白條帶濕轉至PVDF 膜上；5%脫脂奶粉封閉60 min，加入E-cadherin 抗體（1 ∶100 稀釋）、Twsit1 抗體（1 ∶100 稀釋）、Vimentin 抗體（1 ∶50稀釋）、Snail 抗體（1 ∶200 稀釋）和ZEB 抗體（1 ∶200稀釋）孵育，二抗孵育1 h。采用ECL 化學發(fā)光試劑顯影，FluorChem FC3 分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效果

經慢病毒轉染后，SGC-7901 細胞出現GFP 綠色熒光則表示轉染成功。當病毒滴度為1×108PFU/ml時，細胞轉染效率為77.34%。空白對照組、陰性siRNA 組、Gal1-siRNA1 組、Gal1-siRNA2 組SGC-7901 細胞Galectin-1 mRNA 相對表達量分別為（1.00±0.05）、（0.97±0.10）、（0.30±0.07）和（0.85±0.10），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=110.281，P=0.000）。空白對照組、陰性siRNA 組、Gal1-siRNA1 組、Gal1-siRNA2 組Cal-1 蛋白相對表達量分別為（0.68±0.12）、（0.63±0.10）、（0.21±0.07）和（0.56±0.08），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=44.744，P=0.000）。Gal1-siRNA1 組和Gal1-siRNA2 組SGC-7901 細胞Galectin-1 mRNA 和蛋白相對表達量低于空白對照組和陰性siRNA 組（P＜0.05），其中Gal1-siRNA1 組細胞相對表達量最低（P＜0.05），用于后續(xù)實驗。見圖1～5。

圖1 白光和熒光視野下SGC-7901 細胞狀態(tài) （×100）

圖2 SGC-7901 細胞轉染效率

2.2 藥物敏感性

同一藥物濃度前提下，空白對照組、陰性siRNA組和Gal1-siRNA1 組細胞增殖抑制率比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Gal1-siRNA1 組同一藥物濃度下各細胞增殖抑制率均高于空白對照組和陰性siRNA 組（P＜0.05）。見表1。

圖3 各組SGC-7901 細胞Galectin-1 mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

圖4 qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

圖5 流式細胞圖

表1 各組不同藥物濃度下細胞增殖抑制率比較 （%，±s）

表1 各組不同藥物濃度下細胞增殖抑制率比較 （%，±s）

注： ?與Gal1-siRNA1 組比較，P ＜0.05。

組別 5μmol/L 25μmol/L 125μmol/L 625μmol/L空白對照組 10.48±2.11? 17.64±3.28? 48.32±3.43? 69.87±3.81?陰性siRNA 組 11.25±2.23? 18.10±3.72? 50.24±3.29? 70.58±3.76?Gal1-siRNA1 組 14.77±2.19 27.56±3.25 73.84±3.56 78.91±4.10 F 值 8.828 21.398 137.472 13.338 P 值 0.002 0.000 0.000 0.000

空白對照組、陰性siRNA 組和Gal1-siRNA1 組細胞經25μmol/L 阿帕替尼處理24、48、72 和96 h的增殖活性比較，采用重復測量設計的方差分析，結果： ①不同時間點A490nm值有差別（F=181.746，P=0.000）；②3 組細胞A490nm值有差別（F=220.835，P=0.000），與空白對照組和陰性siRNA 組相比，Gal1-siRNA1 組細胞A490nm值較低，增殖抑制活性較好；③3 組細胞A490nm值變化趨勢有差別（F=7.158，P=0.000）。見表2。

表2 各組不同時間點細胞A490nm 值比較 （±s）

表2 各組不同時間點細胞A490nm 值比較 （±s）

注： ?與Gal1-siRNA1 組比較，P ＜0.05。

組別 24 h 48 h 72 h 96 h空白對照組 0.25±0.04? 0.41±0.04? 0.63±0.07? 0.87±0.09?陰性siRNA 組 0.25±0.03? 0.42±0.05? 0.64±0.08? 0.89±0.10?Gal1-siRNA1 組 0.20±0.03 0.36±0.04 0.52±0.07 0.65±0.07

2.3 細胞凋亡活性

加入25μmol/L 阿帕替尼處理48 h 后，經Annexin V/PI 雙染法，空白對照組、陰性siRNA 組、Gal1-siRNA1 組細胞凋亡率分別為（18.97±2.96）%、（19.36±3.25）%和（36.48±3.10）%，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=82.926，P=0.000），Gal1-siRNA1 組細胞凋亡率高于其他組（P＜0.05）（見圖5）。經DAPI 染色，空白對照組、陰性siRNA 組、Gal1-siRNA1 組細胞凋亡率分別為（22.34±5.57）%、（23.85±6.46）%和（40.16±6.55）%，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.598，P=0.023），Gal1-siRNA1 組細胞凋亡率高于空白對照組、陰性siRNA 組（P＜0.05）（見圖6）。

圖6 25μmol/L 阿帕替尼對SGC-7901 細胞凋亡的影響 （DAPI 染色×100）

2.4 沉默Galectin-1 mRNA 表達對上皮間質轉化通路相關蛋白的影響

空白對照組、陰性siRNA 組和Gal1-siRNA1 組細胞E-cadherin、Snail、Vimentin 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與空白對照組和陰性siRNA組比較，Gal1-siRNA1 組細胞E-cadherin 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），而Snail 和Vimentin 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。空白對照組、陰性siRNA 組和Gal1-siRNA1 組細胞Twist 和ZEB 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3和圖7。

表3 各組細胞E-cadherin、Snail、Twist、Vimentin、ZEB 蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組細胞E-cadherin、Snail、Twist、Vimentin、ZEB 蛋白相對表達量比較 （±s）

注： ?與Gal1-siRNA1 組比較，P ＜0.05。

組別 E-cadherin Snail Twist Vimentin ZEB空白對照組 0.68±0.10? 0.42±0.07? 0.43±0.09 0.67±0.08? 0.52±0.11陰性siRNA 組 0.69±0.11? 0.43±0.06? 0.43±0.10 0.66±0.10? 0.53±0.12 Gal1-siRNA1 組 1.03±0.15 0.29±0.05 0.41±0.08 0.43±0.06 0.50±0.12 F 值 21.361 13.308 0.131 22.123 0.137 P 值 0.000 0.000 0.878 0.000 0.873

圖7 E-cadherin、Snail、Twist、Vimentin和ZEB 蛋白的表達

3 討論

甲磺酸阿帕替尼是我國第1 個自主研發(fā)的1.1 類小分子抗腫瘤新藥，也是第1 個被證實用于晚期胃癌患者安全有效的抗血管生成靶向制劑[7]。通過與VEGF 競爭并特異性結合VEGFR-2，抑制VEGFR-2羧基末端和酪氨酸激酶區(qū)域發(fā)生自動磷酸化，進而抑制腫瘤血管生成及細胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為。2016年由李進教授[8]牽頭一項多中心、隨機、雙盲Ⅲ期臨床試驗（NCT01512745）證實甲磺酸阿帕替尼可用于二線治療失敗的晚期胃癌患者和胃食管結合部腺癌患者，不僅能夠有效地控制病情進展和癌性腹水，而且常見的不良反應基本可控，從而大大提高患者的生活質量并延長生存時間。另外戴廣海的研究團隊[9]通過一項多中心Ⅱ期臨床研究（NCT02596256）也證實，在晚期胃癌患者的二線治療中，阿帕替尼聯合多西他賽較多西他賽單藥治療可延長患者無進展生存時間，提高疾病控制率，但是3 級以上毒性反應發(fā)生率高于多西他賽單藥治療組。近幾年，多個研究機構陸續(xù)開展了阿帕替尼用于晚期胃癌一線治療的Ⅰ期臨床研究，包括NCT03255811、NCT02537171 等，但是研究結果尚未公布。

雖然阿帕替尼用于晚期胃癌的臨床療效已被普遍證實，但是其抗癌機制尚不明確。近幾年，隨著阿帕替尼在臨床的使用時間延長，腫瘤細胞敏感性降低的問題逐漸引起相關專家的關注。HUANG 等[10]發(fā)現高表達VEGFR-2 的胃癌細胞對阿帕替尼敏感性更高，并且證實其可能的作用機制與阻斷腫瘤細胞中VEGFR-2/PLCγ1/ERK1/2 信號通路的激活，以及減少VEGF 自分泌，進而抑制胃癌細胞的復制和增殖活力有關。CHEN 等[11]還發(fā)現，Galectin-1 在胃癌組織中呈高表達，并且與VEGF 的含量密切相關，因而筆者推測Galectin-1 與VEGF 在促腫瘤血管生成過程中具有協同作用。本研究委托上海吉瑪公司設計了2 條干擾Galectin-1 表達的siRNA 序列，并轉染至SGC-7901 細胞中，通過反復摸索，證實最佳轉染條件為病毒滴度為1×108PFU/ml 時，細胞轉染率為77.34%。而且分別經qRT-PCR 和Western blotting 驗證，Gal1-siRNA1 的干擾效果最高，Galectin-1 mRNA 和蛋白表達降低最明顯，繼而建立了穩(wěn)轉細胞株以進行后續(xù)實驗。

本實驗進一步通過MTT 法檢測不同濃度阿帕替尼作用于空白對照組、陰性siRNA 組、Gal1-siRNA1組，Gal1-siRNA1 組細胞的增殖抑制率低于空白對照組和陰性siRNA 組，說明下調Galectin-1 表達與提高胃癌細胞對阿帕替尼的敏感性有關。然后采用同一藥物濃度作用于各組細胞，Gal1-siRNA1 組細胞的增殖活性同樣低于空白對照組和陰性siRNA 組，說明阿帕替尼對SCG-7901 細胞的抑制作用不僅具有劑量-效應關系，也具有時間-效應關系。在此基礎上，本實驗進一步采用流式細胞術DAPI 染色法驗證了阿帕替尼對各組細胞凋亡活力的影響。結果也證實阿帕替尼對Gal1-siRNA1 組細胞凋亡活力的影響也大大增加，說明下調Galectin-1 表達可通過促進SGC-7901 細胞的凋亡，增加阿帕替尼的敏感性。

化療藥物敏感性降低往往是治療失敗的主要原因。越來越多的研究表明，上皮間質轉化是胃癌細胞對化療藥物產生耐藥性的主要原因[12]。E-cadherin 是維持上皮細胞極性最主要的細胞黏附分子[13]，而Vimentin 是細胞間充質表型的重要標志[14]。Snail、Twist、ZEB 都是屬于影響上皮間質轉化進程的轉錄因子[15]。本研究中，與空白對照組和陰性siRNA 組比較，Gal1-siRNA1 組細胞E-cadherin 蛋白相對表達量升高，而Vimentin 蛋白和E-cadherin 的轉錄抑制因子Snail 蛋白相對表達量降低，說明下調Galectin-1 表達后，SGC-7901 細胞上皮間質轉化進程受到明顯抑制，因此筆者推測上皮間質轉化可能是Galectin-1 影響阿帕替尼敏感性的作用機制之一，但是具體的作用機制和調控網絡尚需進一步研究。

綜上所述，本實驗通過siRNA 干擾SGC-7901 細胞中Galectin-1 mRNA 和蛋白的表達后，在一定程度上增加了細胞對阿帕替尼的敏感性，其作用機制可能為通過上調E-cadherin 黏附因子的表達，抑制Vimentin 蛋白和Snail 轉錄因子的表達，最終抑制上皮間質轉化進程。