短小芽孢桿菌sRNA Bpsr112的鑒定及功能研究

覃 佳，徐云帆，黃 宇，王海燕

(四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都 610065)

1 引 言

短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SCU11是一株經過復合誘變的菌株，能夠通過發酵培養高效產生胞外蛋白酶，發酵液具有良好的生皮脫毛效果，在生物制革方面具有廣闊的應用前景[1,2].

細菌小RNA(small RNA，又稱作sRNA)是一類能夠轉錄，但通常不編碼蛋白質的RNA，長50-500 nt，大多數由基因組上的基因間隔區編碼，少數由基因編碼區的互補鏈編碼.

基因間隔區的sRNA主要通過不完全的堿基配對與靶基因的mRNA直接結合[3]，影響靶mRNA的翻譯[4]或者穩定性[5]，從而實現對不同靶基因的調控.已有的研究表明，sRNA能參與調控鐵離子代謝[6-7]、碳代謝[8-9]、氨基酸代謝[10-11]、細菌毒力[12]、酸脅迫[13]、氧化脅迫[14]和蛋白酶活[15]等多個生理過程.目前越來越多的sRNA被發現，然而研究多集中在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，革蘭氏陽性菌研究相對較少.

本實驗室前期對短小芽孢桿菌SCU11在發酵培養的各個關鍵生長時期的總RNA進行了鏈特異性轉錄組測序，并預測了sRNA[16].我們發現了一個長約118 nt的sRNABpsr112，在短小芽孢桿菌不同生長時期轉錄活性差異較大，在48 h轉錄活性達到最高，而胞外蛋白酶酶活通常在48 h最高，這暗示Bpsr112可能在這個時期發揮作用.本研究對Bpsr112在短小芽孢桿菌的生長代謝、脅迫應答和蛋白酶活等生理過程中發揮的作用進行了描述.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 菌株和質粒 本研究所用的菌株和質粒詳見表1.

表1 菌株和質粒Tab.1 Strains and plasmids

2.1.2 培養基 發酵培養基(1L)：麩皮25 g，黃豆粉20 g，K2HPO44 g，酵母粉3 g，CaCO33 g，NaH2PO40.4 g，pH =8.3.

M9基本培養基(1L)：Na2HPO4·12H2O 17.096 g，KH2PO43 g，NH4Cl 1 g，NaCl 0.5 g，20%葡萄糖 10 mL，2M MgSO41 mL，0.1M CaCl21 mL.

MM培養基(1L)：蛋白胨10 g，硫酸銨2 g，K2HPO414 g，KH2PO46 g，檸檬酸鈉 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 5g，酵母粉 2.5 g.

群集運動(Swarming)培養基：在LB培養基中補充0.5%(m/v)葡萄糖、0.6%(m/v)瓊脂粉.

2.1.3 主要工具酶和試劑 DIG-Northern Starter kit購自Roche公司；PrimeStar Max、SYBR II以及反轉錄試劑盒購自TaKaRa (大連) 公司；常規rTaq酶和多片段克隆連接試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司；限制性內切酶購自Fermentas (Thermo) 公司；質粒提取、膠回收和純化試劑盒購自OMEGA公司；TRIzol Reagent 購自 Life Technologies 公司；福林酚購自科倫公司；山梨醇、甘露醇、甜菜堿購自生工生物工程上海 (股份) 有限公司；其它試劑均為國產分析純.

2.2 方 法

2.2.1 引物設計 采用Primer 5軟件進行引物設計，表2列出了本研究所用的主要引物信息.

表2 本研究使用的引物Tab.2 Primers used in this study

2.2.2 生物信息學分析Bpsr112的轉錄活性和靶基因 利用生物信息學方法，將短小芽孢桿菌SCU11的轉錄組數據比對到短小芽孢桿菌BA06基因組，生成bam文件，通過IGV可視化Bpsr112的轉錄活性，獲得Bpsr112表達活性堆積圖.利用TargetRNA2和CopraRNA軟件預測靶基因.

2.2.3 總RNA提取、反轉錄和Northern雜交 將過夜活化的菌株接種到30 mL LB中，37 ℃，200 r/min，培養48 h，然后離心收集菌體，加入15 mg/mL 的溶菌酶重懸，37℃，溫浴10 min，最后利用TRIzol提取樣品總RNA.利用反轉錄試劑盒去除gDNA，再進行反轉錄，得到cDNA ，用于qRT-PCR 分析.利用DIG-Northern Starter kit試劑盒進行Northern雜交，先用T7-112-F/R引物擴增出融合T7啟動子的Bpsr112 片段，然后體外轉錄，獲得帶標記的反義鏈RNA探針(用于雜交和Maker)，總RNA電泳后與RNA探針進行Northern雜交，成像觀察.

2.2.4 短小芽孢桿菌電轉化 短小芽孢桿菌SCU11的電轉化參照王超等人[17]建立的高滲透壓電轉化法進行，只是將電壓調整至2 200 V，其余條件和步驟與文獻方法一致．

2.2.5Bpsr112基因敲除載體的構建 以溫度敏感型穿梭質粒pUCETs為骨架載體，以抗性基因kan替代Bpsr112目的基因,構建敲除載體pUCETs-△112，載體的同源臂構建策略如圖1所示.

圖1 敲除載體pUCETs-△112的同源臂構建策略Fig.1 Constructionstrategy of homologous arms in knockout vector pUCETs-△112

2.2.6Bpsr112基因敲除菌株的篩選 通過高滲透壓電轉化法，將敲除載體pUCETs-△112轉化至短小芽孢桿菌SCU11.挑單菌落至5 mL含5 μg/mL紅霉素和10 μg/mL卡那霉素的LB中，30 ℃振蕩培養36 h.再按1%比例接到30 mL無抗LB中，42 ℃振蕩培養12 h，連續傳3代.菌液稀釋后涂布于含4 μg/mL卡那霉素的LB平板，用112screen-F/kan-yz-R引物篩選單交換整合子.挑單交換菌落于5 mL無抗LB中，42 ℃振蕩培養12 h，連續傳2代，菌液稀釋后涂布于含4 μg/mL卡那霉素的LB平板，然后用112screen-F/R引物篩選Bpsr112基因敲除菌株.

2.2.7Bpsr112基因表達載體的構建 用質粒pSU03m作為骨架載體，以SCU11 的gDNA為模板，以GBD-112-F/R為引物，擴增Bpsr112基因和其上下游啟動子、終止子的序列，通過酶切連接插入pSU03m載體，篩選后得到用于過表達的表達載體pSU03m-112.

2.2.8 生長曲線的測定 將過夜活化的菌液稀釋到OD600nm=1.0，然后按1%比例轉接到30 mL M9液體培養基中，再在37 ℃，200 r/min培養，在合適的時間點取樣，測量OD600nm時的吸光值，繪制生長曲線.鹽脅迫實驗在含有0.8 mol/L NaCl的MM培養基中進行，然后測生長曲線.

2.2.9 運動性實驗 將過夜活化的菌液稀釋到OD600nm=1.0,吸取1 μL實驗菌液和對照菌液，點在同一個Swarming平板上，然后正置于37 ℃培養箱，12 h，拍照觀察，每組3個重復.

2.2.10 發酵培養及蛋白酶活測定 將過夜活化的菌液稀釋到OD600nm=1.0，然后按照4%的比例接種至25 mL發酵培養基中，每個菌株三個重復，34 ℃，200 r/min培養，分別在48 h、60 h、72 h和84 h收集發酵液，13 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清測定蛋白酶活，蛋白酶活的測定按照蛋白酶活測定標準GB/T 23527-2009[18]進行.

3 結 果

3.1 轉錄組數據分析顯示Bpsr112是一個差異表達的sRNA

本實驗室前期對短小芽孢桿菌SCU11在各個發酵時期的總RNA進行了鏈特異性轉錄組測序.本研究首先對轉錄組數據中Bpsr112在不同時間點的RPKM值以及Bpsr112及其鄰近染色體區域的reads覆蓋情況進行了分析，結果顯示(圖2A)，Bpsr112在不同時間點差異轉錄，在36 h之前幾乎沒有表達，但在48 h迅速達到峰值，然后下降，初步推測Bpsr112發揮功能是在48 h，而前期的實驗結果表明，胞外蛋白酶酶活通常是在48 h達到最高.我們進一步分析了48 h轉錄組樣品中Bpsr112和其鄰近基因位置的reads覆蓋情況，結果顯示(圖2B)Bpsr112的轉錄方向和染色體上的下游基因RI02_RS06200(編碼假設蛋白)相反，與上游基因RI02_RS06195(ispA，編碼絲氨酸蛋白酶)轉錄方向相同，并且與ispA基因啟動子部分重疊.進一步比較6 h，12 h和48 h的reads堆積圖，結果顯示(圖2C)Bpsr112所在區域在6 h和12 h均無reads覆蓋，但上游基因RI02_RS06195卻一直在表達，因此推測Bpsr112是一個獨立轉錄的sRNA，不屬于上游基因的5’UTR區域.

圖2 轉錄組分析Bpsr112的表達水平(A)Bpsr112在不同時間點轉錄水平的RPKM值；(B)48 h樣品中Bpsr112和其鄰近染色體區域的reads覆蓋情況；橫坐標表示DNA長度，縱坐標為reads的覆蓋數目，紅色表示染色體正義鏈的reads覆蓋度，藍色表示反義鏈的reads覆蓋度，綠色箭頭表示Bpsr112基因及其方向，黑色箭頭表示鄰近基因及其方向；(C)2 h、6 h、12 h、48 h四個時間點Bpsr112和其上游基因RI02_RS06195在染色體上的reads覆蓋情況.Fig.2 Transcriptome analysis of Bpsr112 expression levels(A)RPKM value ofBpsr112 at different time points;(B)the reads coverage of Bpsr112 and its adjacent chromosomal regions in 48h; the abscissa represents the length of DNA，the ordinate represents the number of reads coverage，the red region represents the reads coverage of sense chain，the blue region represents the reads coverage of antisense chain，the green arrow represents the Bpsr112 gene and its direction，the black arrow represents the adjacent gene and its direction;(C) the reads coverage of Bpsr112 and its upstream gene RI02_RS06195 at 2 h,6 h，12 h and 48 h.

3.2 Bpsr112基因序列保守性分析

通過NCBI比對分析Bpsr112基因序列，發現Bpsr112基因在隨機挑選的19個短小芽孢桿菌株(B．pumilus)中高度保守，在親緣關系很近的B.cellulasensis、B.aerophilus、B.safensis、B.sp. WP8、B.altitudinis等菌株中都存在同源序列.用進化樹分析Bpsr112序列保守性，如圖3所示，在紅色方框的六個菌株中，Bpsr112序列的一致性達到100%，具有高度的結構和序列保守性.但是另一方面，在模式菌株枯草芽孢桿菌168中卻不存在Bpsr112，這或許和親緣關系的遠近以及sRNA的物種特異性有關.

圖3 Bpsr112序列的進化樹Fig.3 Evolutionary tree of Bpsr112 sequence

圖4 Northern雜交鑒定sRNA Bpsr112總RNA上樣量為10 μg，M為帶標記的RNA探針，左邊顯示探針長度.Fig.4 Northern blot ofsRNA Bpsr112The total RNA sample loading volume is 10 μg，M is labeled RNA probe，and the length of probe is shown on the left.

3.3 Northern雜交鑒定Bpsr112

Northern雜交是驗證基因轉錄的標準實驗.因為轉錄組測序顯示Bpsr112在48h表達水平最高，因此將SCU11發酵到48 h的總RNA進行Northern雜交，結果如圖4所示，Bpsr112產生一條雜交帶，而且大小和探針一致，說明和轉錄組預測的118 nt基本一致，而且證明它是獨立轉錄的sRNA.

3.4 Bpsr112的靶基因預測

由基因間隔區編碼的sRNA主要通過不完全的堿基配對與靶mRNA結合，影響靶mRNA的翻譯或穩定性.了解sRNA結合的靶基因，對于深入研究sRNA功能和后續實驗具有指導作用.因此，采用不同軟件對Bpsr112的潛在靶基因進行預測.利用TargetRNA2軟件預測出30個靶基因，利用CopraRNA軟件預測出的200個靶基因，表3，表4分別展示前15個預測的靶基因，功能涉及氨基酸代謝、細胞壁合成、細菌運動性等多個生理代謝.其中，TargetRNA2預測的靶基因fliM與細菌的運動性相關，glmS參與細胞壁的形成.CopraRNA預測出蛋白酶基因aprE，而AprE是短小芽孢桿菌胞外蛋白酶活的主要貢獻者，因此Bpsr112具有深入研究價值.但是，兩個軟件預測的靶基因幾乎沒有重合.

表3 TargetRNA2預測Bpsr112靶基因Tab.3 Bpsr112 targets predicted by TargetRNA2

表4 CopraRNA 預測Bpsr112靶基因Tab.4 Bpsr112 targets predicted by CopraRNA

3.5 Bpsr112敲除菌株及過表達菌株的構建

為了研究Bpsr112功能，利用同源重組的方法構建敲除菌株.先通過PCR擴增出Bpsr112的上下游同源臂flank A和flank B，以及卡那霉素抗性基因Kan，通過重疊PCR將三個片段連接起來得到融合片段flank A-kan-flank B，再將它插入雙酶切后的載體pUCETs，得到敲除載體pUCETs-Δ112.

通過高滲透壓電轉化法，將敲除載體pUCETs-Δ112轉化至短小芽孢桿菌SCU11菌株，經過雙交換和質粒丟失后，通過PCR篩選得到Bpsr112基因敲除菌株，通過PCR及測序驗證，表明Kan基因成功替換Bpsr112，敲除菌株命名為SCU11(Δ112).

將染色體上的Bpsr112完整基因擴增下來，插入到載體pSU03m上，得到pSU03m-112表達載體.然后通過高滲透壓電轉化法，將pSU03m-112表達載體和pSU03m空載體轉化SCU11，通過PCR篩選，功得到Bpsr112過表達菌株及其對照菌株，分別命名為SCU11/pSU03m-112和SCU11/pSU03m.

3.6 生長曲線的測定和鹽脅迫實驗

許多sRNA對細菌生長和脅迫應答具有調控作用，而Bpsr112預測的靶基因涉及到細胞壁/膜/包膜合成，Bpsr112是否可能對細菌生長和脅迫產生影響？將SCU11，SCU11(Δ112)，SCU11/pSU03m和SCU11/pSU03m-112共4種菌株過夜活化，然后接到M9基本培養基中培養，分別在3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取樣，測量吸光值，繪制生長曲線，結果如圖5(A)所示，實驗組與對照組的生長情況沒有明顯的差異，表明Bpsr112不影響生長.

圖5 生長曲線和鹽脅迫實驗(A)4種菌株在M9基本培養基中的生長曲線；(B)4種菌株在鹽脅迫條件下的生長曲線.Fig.5 Growth curve and salt stress experiment(A) Growth curves of 4 strains in M9 basic medium; (B) growth curves of 4 strains under salt stress.

將4種菌株接到含有0.8 mol/L NaCl的MM培養基中培養，分別在4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h取樣，測量吸光值，繪制生長曲線.結果如圖5(B)所示，4種菌株的生長曲線幾乎重合，表明Bpsr112不參與鹽脅迫的調節.

3.7 運動性實驗

Bpsr112預測的靶基因中fliM編碼鞭毛運動開關蛋白，表明Bpsr112可能與細菌運動有關.利用Swarming運動平板研究Bpsr112對細菌運動性的影響.將SCU11，SCU11(Δ112)，SCU11/pSU03m和SCU11/pSU03m-112共4種菌株過夜活化，稀釋OD值到1.0，分別取1 μL菌液，點在Swarming運動平板上.培養12 h，觀察拍照.結果如圖6所示，實驗組與對照組差異不明顯，表明Bpsr112可能不參與短小芽孢桿菌運動性的調控.

圖6 Bpsr112對細菌運動性的影響Fig.6 Effects of Bpsr112 on mobility of strains

3.8 Bpsr112對胞外蛋白酶酶活的影響

Bpsr112的候選靶基因還包括堿性蛋白酶基因aprE.將4種菌株過夜活化，然后接到發酵培養基中培養，由于蛋白酶主要在發酵后期產生，因此分別在48 h、60 h、72 h和84 h收集上清液，測定蛋白酶活.結果如圖7(A)所示，在48 h時，4種菌株酶活差異不明顯；在60 h和72 h時，敲除后的菌株酶活顯著降低(P<0.01)，過表達后酶活顯著提高(P<0.01)，其中60 h時，過表達菌株平均酶活達到4702 U/mL，比對照菌株提高了153%；在84 h時，敲除后酶活差異不明顯，但是過表達后酶活顯著提高(P<0.01).

將60 h和72 h的發酵上清液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖7(B)所示，與對照相比，AprE蛋白含量在敲除菌株中降低，在過表達菌株中提高，這與蛋白酶活測定的結果一致.結果表明Bpsr112對短小芽孢桿菌胞外蛋白酶酶活具有正調控作用.

圖7 Bpsr112對胞外蛋白酶酶活的影響(A)4種菌株發酵48 h、60 h、72 h、84 h時的蛋白酶酶活；(B)4種菌株發酵 60 h、72 h時的上清液的SDS-PAGE電泳. M1：AprE蛋白標準品，略小于35 kDa；M2：蛋白Maker；數字1、2、3、4分別表示SCU11，SCU11(Δ112)，SCU11/pSU03m 和SCU11/pSU03m-112四種菌株.Fig.7 Effects of Bpsr112 on extracellular protease activity(A) Protease activities of 4 strains at 48 h，60 h，72 h and 84 h; (B) SDS-PAGE electrophoresis of supernatant of 4 strains at 60 h and 72 h. M1:AprE protein standard，slightly less than 35 kDa; M2: protein maker; numbers 1，2，3，4 represent SCU11，SCU11 (Δ112)，SCU11/psu03m and SCU11/psu03m-112，respectively.

4 討 論

短小芽孢桿菌SCU11能夠通過發酵培養，高效產生胞外蛋白酶.實驗室前期已經對各個發酵關鍵時期的菌液進行了轉錄組測序，我們通過分析發現了一個長118 nt的新sRNABpsr112，并且通過Northern雜交證明Bpsr112能夠獨立轉錄.為了探究Bpsr112的功能，根據預測的靶基因的功能，我們對野生型、Bpsr112敲除及過表達菌株進行了鹽脅迫和運動性實驗比較，結果表明Bpsr112并無明顯的調控作用.一方面的原因可能是生物信息學軟件預測的可靠性比較低，存在假陽性.生物信息學軟件預測靶基因主要是根據sRNA的保守性、sRNA二級結構、mRNA二級結構以及sRNA-mRNA相互作用的自由能來預測靶基因.但是保守的序列并不容易獲取；高結合能也并不意味著一定能和mRNA有效結合；sRNA與靶基因的作用還可能會受到蛋白質的影響，這又會嚴重地影響軟件預測[19].另一方面可能是因為調控細菌鹽脅迫和運動性的網絡比較復雜，Bpsr112突變的影響可能被其他調節途徑恢復了，因此未表現出明顯的差異.

CopraRNA軟件預測出蛋白酶基因aprE是Bpsr112潛在的靶基因，而AprE是短小芽孢桿菌胞外蛋白酶活的主要貢獻者.通過Bpsr112敲除菌株和過表達菌株的蛋白酶活實驗，結果表明Bpsr112對胞外蛋白酶活具有正調控作用.推測Bpsr112能夠促進aprE基因的表達，從而提高胞外蛋白酶酶活，但這種促進作用是直接的還是間接的，則需要更多的實驗鑒定.一般來說，sRNA直接激活靶基因的機制可能是由于靶mRNA的5’UTR區域存在二級結構封閉了RBS位點，核糖體無法結合上去.一些sRNA可以與靶mRNA結合，改變該二級結構，暴露出RBS位點，從而激活翻譯.也可能是由于sRNA的結合封閉了RNA酶的切割位點，增強了mRNA的穩定性，從而促進翻譯[20].通過Mfold軟件預測aprEmRNA(5’UTR和起始密碼子后部分區域)的二級結構，如圖8(A)所示，aprEmRNA的RBS位點區域(通常RBS位于起始密碼子前8～13個核苷酸)形成了二級結構，封閉了RBS位點.CopraRNA軟件預測Bpsr112可與aprEmRNA形成堿基配對，如圖8(B)所示.當aprEmRNA(紅色區域部分)與Bpsr112結合后，原先的二級結構被改變，RBS位點暴露出來，從而可能激活aprE基因翻譯.有研究表明sRNA可直接或間接地調控芽孢桿菌蛋白酶基因表達，例如，在地衣芽孢桿菌中，由apr基因反義鏈編碼的sRNA AprAs可以通過堿基配對，抑制枯草桿菌蛋白酶(Apr)的表達[15].在枯草芽孢桿菌中，sRNA RnaC/S1022可以通過調節全局轉錄調控因子AbrB來負調控aprE基因的表達[21].Bpsr112與aprE之間的相互作用需要進一步的實驗驗證，比如利用報告基因探究Bpsr112與aprEmRNA的直接相互作用.這對系統揭示Bpsr112的功能至關重要，對進一步提高短小芽孢桿菌的酶活也有重要意義.

圖8 Bpsr112與aprE mRNA相互作用分析(A)aprE mRNA二級結構，紅色區域為預測的結合位置，綠色區域為推測的 RBS位點，紫色區域為起始密碼子；(B)預測Bpsr112與aprE mRNA的堿基配對，紅色區域對應于(A)的紅色區域，藍色區域為sRNA的主要結合區域.Fig.8 Interaction betweenBpsr112 and aprE mRNA(A) Secondary structure ofaprE mRNA. The red region is the predicted binding site，the green region is the predicted RBS site，and the purple region is the initial codon. (B) Predicted base pairing of Bpsr112 and aprE mRNA. The red region corresponds to the red region of (A)，and the blue region is the main binding region of sRNA.

5 結 論

本研究通過分析短小芽孢桿菌的轉錄組數據，發現了一個新sRNABpsr112，并通過Northern雜交進行鑒定.通過敲除菌株和過表達菌株，進行生長曲線、鹽脅迫和蛋白酶活等實驗，發現Bpsr112對蛋白酶活具有正調控.本研究首次描述了短小芽孢桿菌中具體的sRNA功能，對于進一步提高短小芽孢桿菌的酶活具有重要意義.