過表達本氏煙基因NbPAP2對轉基因植物生長發育的影響

代庭偉，呂雪艷，陳 放，徐 鶯

(四川大學生命科學學院 教育部生物資源與生態環境重點實驗室，成都 610065)

1 引 言

磷是植物生長發育所必需的重要元素之一.作為核糖核酸和脫氧核糖核酸的重要組成部分，磷不僅影響細胞的分裂和分化，同時還參與光合作用過程中蔗糖的生物合成，促進植物生長發育，有利于種子的養分積累[1].酸性磷酸酶(APase)是酸性條件下(pH<7.0)能催化磷酸單酯或酸酐裂解從而釋放無機磷酸根離子的水解酶類[2].其中的紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatase，PAP)因其酶提取液呈紫色或粉色而得名.PAP除具有酸性磷酸酶都有的5個保守結構域和雙金屬離子催化中心外，其活性還不受酒石酸鹽抑制[3-4].研究顯示紫色酸性磷酸酶在植物應答低磷脅迫時，通過其水解磷化合物的能力來調節磷的獲取和再分配[5].此外，一些PAPs除了參與磷代謝外，還具有其他的生物學功能.例如大豆GmPAP3[6]和擬南芥AtPAP17[7]具有過氧化物酶活性.煙草NtPAP12可以使載脂蛋白的磷酸化殘基去磷酸化，可能參與細胞壁再生過程[8].通過C端疏水基序同時靶向葉綠體和線粒體的擬南芥AtPAP2則是參與植物的碳代謝過程，有報道指出，過表達AtPAP2的擬南芥蔗糖磷酸合成酶SPS活性和蔗糖含量均提高，生長發育加速并且種子產量增高[9].

茄科(Solanaceae)植物廣泛分布于熱帶及溫帶地區，其中有多種重要的蔬菜、經濟、觀賞和藥用植物，如馬鈴薯、番茄、辣椒、茄子、枸杞、煙草、天仙子、碧冬茄等.產量或生物量是農業生產上衡量茄科植物的重要經濟指標之一，因此對于茄科植物磷元素吸收及利用機制的研究具有重要意義.本氏煙(Nicotianabenthamiana)是茄科植物的一員，也是常見的模式植物，對其磷利用機制的研究有助于茄科植物的品種改良.因此本文利用生物信息學、分子生物學及生理學相關技術對AtPAP2同源基因NbPAP2功能的初步研究，了解其在蔗糖代謝和增加植物產量相關途徑中可能發揮的作用，為茄科植物產量的增加提供新的思路和方法.

2 材料和方法

2.1 材 料

2.1.1 植物材料 本氏煙(Nicotianabenthamiana)由四川大學生命科學學院植物發育與生殖實驗室保存.

2.1.2 PCR引物 見表1.

表1 PCR擴增引物Tab.1 Primers for PCR assays

2.2 方 法

2.2.1NbPAP2基因的克隆 以擬南芥AtPAP2基因序列為模板，在本氏煙基因組Nicotianabenthamianadraft genome sequence v1.0.1數據庫(https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_benthamiana/genome)中進行序列比對，選擇同源性最高的基因序列，根據所得基因序列設計引物NbPAP2-F和NbPAP2-R(表1)，通過PCR擴增獲得.

2.2.2 生物信息學分析 序列同源性比較采用BLASTn/BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi)和CLC sequence Viewer6 (本地)；信號肽預測采用SignalP 4.1 Server(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；疏水性預測采用ExPASy-ProtScale(https:// web. expasy.org/protscale/)；亞細胞定位采用PredictProtein(https://www. predictprotein.org/).

2.2.3 熒光定量PCR分析 利用RNAPrep Pure Plant Kit試劑盒(天根)提取本氏煙各個不同組織：根、莖、幼葉、成熟葉、花瓣、花萼、幼果、成熟果的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)將所提取RNA反轉錄成cDNA，然后用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒(Bio-Rad)在Bio-Rad IQ5 PCR儀進行qRT-PCR反應，引物序列見表1.

2.2.4 過表達轉基因植株的獲得及鑒定 通過同源重組方法將NbPAP2基因插入pKSE-35S載體XbaⅠ和SacⅠ之間(圖1)，測序鑒定后導入根癌農桿菌，使用葉圓盤法轉化本氏煙葉片外植體，對獲得的卡納霉素抗性植株進行PCR篩選，然后用q-PCR方法對PCR陽性植株NbPAP2的轉錄水平進行定量分析.所用引物見表1.

圖1 重組載體pKSE-NbPAP2線性圖譜及引物位置Fig.1 Linear map of the recombinant vector pKSE-NbPAP2 and primer positions

2.2.5 光合速率和氣孔導度的測定 于上午8：30～11：00間，選取株齡90 d植株的完全展開葉片，每一株系選取三株，每株選取三片，使用CIRAS-2便攜式光合/熒光測定系統(英國PP Systems公司)，分別測定光合有效輻射(Photosynthetically active radiation，PAR)為200、400、600、800、1000μmol/m2/s時的光合速率(Pn)和氣孔導度(Gs)的值，每個葉片測定三次.

2.2.6 轉基因煙草蔗糖含量測定 蔗糖含量采用蒽酮比色法[10]測定新鮮成熟煙草葉片(避開主葉脈).

2.2.7 轉基因煙草SPS酶活性測定 蔗糖磷酸合成酶SPS的活性采用間二苯酚法測定[11].

3 結果與分析

3.1 本氏煙紫色酸性磷酸酶家族成員NbPAP2主要在成熟組織表達

以擬南芥AtPAP2基因序列為模板，通過序列比對，在本氏煙基因組數據庫(Nicotianabenthamianadraft genome sequence v1.0.1)中獲得與其同源性最高的同源基因序列信息(登錄號Niben101Scf04400g02005.1)，然后以本氏煙植株的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板擴增得到該基因，命名為NbPAP2.NbPAP2基因開放讀碼框全長1959bp，推測的蛋白質含652個氨基酸殘基.與普通煙草(Nicotianatabacum)、辣椒(Capsicumannuum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、番茄(Solanumlycopersicum)中同源基因(XM_016654955.1、XM_016717209.1、XM_006344186.2、XM_004237004.4)的核酸序列相似性分別達到96%、88%、87%、86%，而與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPAP2(NM_101256.3)核酸序列的相似性為68%，氨基酸序列同源性則為64.2%.SignalP 4.1 Server預測出NbPAP2在N端存在信號肽(圖2A)，在線ProtScale模塊預測出多肽鏈第622位氨基酸處疏水性最強(圖2B)，Protein Predict預測的結果顯示NbPAP2蛋白可能定位于葉綠體(圖2C)，這與AtPAP2蛋白預測結果一致從而或許與其他植物PAP蛋白存在差異.

為了了解NbPAP2是否屬于紫色磷酸酶家族成員，對本氏煙草、普通煙草、辣椒、馬鈴薯和擬南芥共五個PAP2成員和一個AtPAP9進行氨基酸序列比對分析后，發現它們都具有紫色酸性磷酸酶家族的特征基序，即由五個保守基序(DXG/ GDXXY/ GNH(D/E))/VXXH/GHXH)構成的雙核金屬離子中心[12]，同時與金屬離子結合的七個關鍵氨基酸殘基也非常保守(圖1D).這似乎說明茄科植物的PAP成員與十字花科的擬南芥PAP具有一定程度上相似的功能.

提取野生型本氏煙植株的根、莖、幼葉、成熟葉、幼果、成熟果、花萼以及花瓣等不同組織的總RNA，反轉錄后使用qRT-PCR方法測定NbPAP2的轉錄水平，結果顯示，NbPAP2在各個組織中均有不同程度的表達，其在花瓣中表達量最高，顯著高于其他生物組織.在葉片和莖中的表達量次之，在根和果實中表達量最低.除此之外，NbPAP2在成熟葉和成熟果中的表達量略高于幼葉和幼果 (圖1E).

3.2 NbPAP2過表達促進植物生長和種子發育

為了探究過表達NbPAP2對煙草生長發育的影響，通過農桿菌介導的轉化方法獲得4個表達穩定且表達量相對較高的轉基因株系(OE-1、OE-2、OE-3和OE-4)，對4個株系的T1代卡那霉素抗性植株的表型進行觀察及統計.觀察發現，轉基因植株生長速度較野生型明顯加快，株型更加高大，并且這些改變與NbPAP2的表達水平呈正相關性(圖3A、B).過表達NbPAP2還導致轉基因植株花期提前(表2).在過表達株系OE-1和OE-2中NbPAP2的表達水平比野生型均高了10倍以上，花期比野生型植株提前了9～14 d.OE-3與OE-4株系中NbPAP2的表達水平分別是野生型的4到7倍，其花期改變就沒有前兩個株系顯著，與對照相比，差異僅為2～3 d.

圖2 NbPAP2的生物信息學分析和表達時空性分析Fig.2 Bioinformatics analysis and spatiotemporal expression profile of NbPAP2A.信號肽預測；B. 疏水性分析；C. 亞細胞定位預測；D. 氨基酸序列比對(矩形所標注的為5個氨基酸保守基序；三角所標注的為7個不變氨基酸殘基)；E. 組織表達特異性的定量PCR分析.A. Signal peptide prediction; B. hydrophobicity analysis; C. subcellular localization prediction; D. amino acid sequence alignment (5 amino acid conserved motifs marked by rectangle; 7 invariant amino acid residues marked by triangle); e. quantitative PCR analysis of tissue expression specificity.

圖3 轉基因煙草植株的表型Fig. 3 Phenotype of transgenic tobacco plantsA. 野生型(WT)和過表達(OE-1、OE-2)植株；B.NtPAP2在野生型(WT)和過表達(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4)植株中的相對轉錄水平；C. 野生型(WT)和過表達(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4)植株的種子；D. 野生型(WT)和過表達(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4)植株種子的質量.A. Wild type (WT) and NbPAP2 over expression (OE-1，OE-2) plants; B. relative transcription level of NbPAP2in WT and over expression (OE-1，OE-2，OE-3，OE-4) plants; C. seeds of WT and over expression (OE-1，OE-2，OE-3，OE-4) plants; D. seed quality of WT and over expression (OE-1，OE-2，OE-3，OE-4) plants.

表2 野生型植株與轉基因植株的開花時間Tab.2 Flowering time of wild type plants and transgenicplants

不僅如此，我們還觀察到，與野生型植株相比，OE-1、OE-2兩個過表達株系的種子更為飽滿，種子的寬度和長度都有所增加，但其他兩個過表達株系種子變化不明顯(圖3C).進一步測定各株系種子的百粒重(圖3D)，OE-1、OE-2兩個過表達株系的種子質量顯著高于野生型種子，提高了約23%～25%(圖2D).盡管如此，野生型植株和轉基因株系每個果實中的種子數量沒有明顯變化.

3.3 NbPAP2過表達影響植物光合作用和碳代謝

選取完全展開的成熟葉片測定光合速率和氣孔導度發現.與野生型相比，OE-1和OE-2株系凈光合速率分別增強了26%和20%.其他兩個株系OE-3和OE-4，雖然凈光合速率改變的幅度較小，但其凈光合速率相較于野生型也增強了5%左右(圖4A).在光合植物的葉片中，氣孔導度與葉肉細胞對CO2的需求相一致[13]，氣孔導度越大，植物的凈光合速率就越大.測定結果顯示，轉基因株系OE-1和OE-2的氣孔導度增加了33%和28%，OE-3和OE-4也有明顯增加(圖4B).與野生型植株相比，過表達NbPAP2煙草的氣孔導度與光合速率的變化具有一致性，同時也與基因表達水平有明顯的相關性.

圖4 過表達NbPAP2影響轉基因植物的光合作用和碳代謝Fig.4 Overexpression of NbPAP2 affects photosynthesis and carbon metabolism in transgenic plantsA.野生型植株與轉基因植株的凈光合速率；B.野生型植株與轉基因植株的氣孔導度；C.野生型植株與轉基因植株葉片的蔗糖含量；D.野生型植株與轉基因植株葉片SPS活性.A. Net photosynthetic rate of wild type plants and transgenic plants; B.stomatal conductance of wild type plants and transgenic plants; C. sucrose content of wild type plants and transgenic plants; D. SPS activity of wild type plants and transgenic plants.

糖和糖原代謝信號影響植物的源庫平衡和碳分配，也影響光合基因的轉錄[14].分析顯示所有過表達NbPAP2株系的蔗糖含量均低于野生型煙草的蔗糖含量.OE-1和OE-2過表達NbPAP2株系的差異更為顯著，蔗糖含量分別降低了25%和17%(圖4C).蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖合成途徑中的關鍵酶之一，它不可逆地催化F6P和UDPG合成S6P，從而促進蔗糖的合成.為了了解導致轉基因植株蔗糖水平下降的原因，我們進一步測定了轉基因植株和野生型植株葉片中的SPS活性.出乎意料的是，與野生型相比，過表達植株的SPS活性均有不同程度的增強，而且OE-1與OE-2株系與野生型的差異較其他兩個株系更為顯著，其SPS酶活性分別增強了30%和33%(圖4D).

4 討 論

功能多樣的紫色磷酸酶廣泛分布在各種生物中.與擬南芥AtPAP2相比，本氏煙NbPAP2基因的表達產物的結構特征、組織表達特異性和過表達植株的表型，既有相似之處，但也有不一樣的地方.

在結構方面，雖然NbPAP2與AtPAP2的氨基酸序列同源性為64.2%，但預測的結構特征與AtPAP2極為相似，如N端的信號肽、C端的強疏水性基序和葉綠體靶向.當然，研究顯示AtPAP2實際上是葉綠體和線粒體雙定位[15]，NbPAP2是否同樣靶向線粒體則還有待進一步證實.

在組織表達特異性方面，雖然NbPAP2在各組織中都被檢測到表達，成熟組織中的表達略高于幼嫩組織，但表達豐度最高的組織卻是花瓣，這與AtPAP2的表達模式存在差異.同時，考慮到通常情況下花瓣并非植物進行光合作用的器官，因此這暗示NbPAP2可能還有促進光合作用之外的其它功能.Guo等人的研究顯示，充足的糖分對花色素的合成有促進作用[16-17]，因此NbPAP2很可能在本氏煙花色的形成中發揮著重要的作用.

在過表達轉基因植株表型方面，過表達AtPAP2和NbPAP2均促進花期提前，同時種產量增加.不過值得注意的是，前者產量的增加是種子數量和質量共同增加的結果，但過表達NbPAP2并沒有增加轉基因植株的種子數量，產量增加僅僅是由于種子質量增加所致.同樣，過表達NbPAP2雖然促進了轉基因植株的光合作用以及蔗糖合成關鍵酶基因的表達，但葉片中蔗糖的含量反而降低，并且降低的程度與基因表達的水平呈負相關關系.類似的結果在亞麻芥中有相關報道[18].一般來說，葉片中蔗糖的含量是由SPS控制下的蔗糖合成速率、葉片輸出速率和光合作用速率共同決定的[19-20].較高的光合速率和SPS數量及活性導致蔗糖的增加，高效的蔗糖輸出速率則會降低蔗糖的水平.因此在過表達AtPAP2的亞麻芥和過表達NbPAP2的本氏煙中，葉蔗糖含量降低可能是蔗糖高效運輸大于光合速率及蔗糖合成速率的結果.蔗糖含量的降低可以減輕高濃度蔗糖對光合作用和SPS活性的反饋抑制，進一步促進碳固定，并進而導致轉基因植株生長速率提升、早花及種子產量提高.

還需要指出的是，過表達PAP2類的基因都促進了轉基因植物種子體積和質量的增加，這對于以種子為目標產品的植物無疑是有益的.但是對于茄科的番茄、辣椒、茄子、枸杞等這些以整個果實而非種子為產品的植物，在應用該策略時需要考慮到種子過大對食物口感的影響.