FBXO7載體構建及其對結直腸癌細胞生物學行為影響的初步探討

唐月陽 易紅 李星枝 龍漢安 王艦梅

1四川大學華西口腔醫院病理科（成都610041）；西南醫科大學附屬醫院2細胞室，3病理科（四川瀘州646000）

結直腸癌是目前全球最常見惡性腫瘤之一，其發病率居第2 位，呈現逐年上升的趨勢［1］。近年來研究發現，結直腸癌發病原因與不良生活方式、飲食習慣、腸道菌群紊亂、大腸腺瘤及遺傳因素等各方面關系密切［2］。其中約85%的結直腸癌是由結直腸癌息肉中的腺瘤逐步演變而來［3］。手術切除仍是目前治療結直腸癌的主要方式，術后輔以放化療，使結直腸癌治療取得較明顯的進步，但患者長期生存情況仍然較差［4］。因此，探討結直腸癌的發生和發展機制，篩選早期生物標志物，尋找新的治療靶點，對臨床診斷及治療結直腸癌都顯得格外重要。

F-box 蛋白7（F-box protein 7，FBXO7）是新發現的F-box 蛋白家族成員之一，F-box 是由40 個氨基酸殘基組成的一個特征性的酸性結構域［5-6］。F-box 家族參與組成SKP1-CUL1-F-box（SCF）復合物，是泛素化系統的重要組成部分［7］。目前國內外學者對于FBXO7 的研究不多，并且主要都集中在帕金森病方面，在腫瘤領域中的研究較少。研究發現，FBXO7 在肺鱗狀細胞癌和結直腸腺癌組織中過表達，提示FBXO7 很可能在肺癌和結直腸癌的發生發展過程中扮演重要角色［8］。同時FBXO7 也參與了細胞周期控制，調控相關生物因子并被認為是一種原癌基因［9］。本實驗檢測FBXO7 在結直腸癌細胞中的表達情況，并成功構建GV230-FBXO7 表達載體，檢測其過表達對結直腸癌細胞生物學行為影響，初步探討FBXO7 調控結直腸癌細胞增殖、周期及遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料人結直腸癌細胞株均為病理科實驗室保存提供；引物均由上海生工生物工程公司合成；大腸桿菌感受態細胞、GV230 質粒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；DNA 電泳凝膠回收試劑盒、質粒小提中量取試劑盒、瓊脂糖粉均購于天根生化公司；RNAiso Plus、逆轉錄試劑Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMII 和DNA Marker、T4 連接酶、限制性內切酶XhoI 和KpnI 均購自日本Takara 公司；轉染試劑Lipofectamine?2000 購自美國Invitrogen 公司；細胞周期檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司；Enhanced Cell Counting Kit-8（增強型CCK-8試劑盒）購自碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 人結直腸癌細胞總RNA 提取和逆轉錄取出培養結直腸癌細胞的培養瓶，倒掉培養基，用預冷的PBS 沖洗2 ～3 遍，緩慢加入1 mL RNAiso Plus 后冰上靜置5 ～10 min。具體按照說明書提取總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度，OD260/OD280比值在1.7 ～2.2 為佳，放-80 ℃冰箱保存備用。按照Takara 公司的逆轉錄試劑盒說明將RNA 逆轉錄成cDNA，放-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 熒光定量PCR 檢測FBXO7 的mRNA 的表達提取結直腸癌細胞總RNA 并逆轉錄成cDNA。通過SYBR?Premix Ex TaqTMII 方法進行熒光定量PCR 檢測，從而在轉錄水平檢測FBXO7 的表達。用于熒光定量PCR 的FBXO7 引物如下：上游引物，5′-TGCTCTGTAGTGAATCGGTGGA-3′；下游引物，5′-CTTCGGTGCCCTGAGGTATG-3′；以GADPH做內參，引物如下：上游引物，5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′ ；下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.2.3 引物設計合成與目的基因的擴增根據GV230 酶切位點，設計FBXO7 的擴增引物：分別選取FBXO7 基因編碼區雙側序列，分別加入XhoI 和KpnI 內切酶酶切位點和保護堿基，上游引物5′-TACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGAGGCTGCGGGTGCGGCTTC-3′；下游引物5′-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCATGAATGACAG CCGGCCATCAG-3′。取上述cDNA 為模板，加入FBXO7 前后引物根據說明書進行PCR 擴增。擴增條件：98 ℃預變性5 min →98 ℃變性10 s →55 ℃退火10 s →72 ℃延伸90 s →（共30 個循環）→再延伸8 min，產物放-20 ℃冰箱保存，將PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 FBXO7 載體構建取PCR 擴增的FBXO7序列用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時根據無內毒素質粒小提中量試劑盒說明小提質粒GV230 質粒，并經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收并純化酶切產物。于16 ℃循環水浴鍋中將上述制備純化的FBXO7 序列與線性化雙粘性末端的GV230 載體片段按比例用T4 DNA 連接酶置連接反應過夜，60 ℃滅活連接產物10min 后轉化至大腸桿菌感受態細胞，經卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單克隆菌落，接入LB 培養基中，根據質粒提取試劑盒，從菌液中提取重組質粒GV230 - FBXO7 并進行雙酶切鑒定和質粒測序。

1.2.5 Western blot 法取轉染后72 h生長良好的結直腸癌細胞，提取總蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，蛋白液中加入5×loading buffer，水浴鍋中煮沸至100 ℃，使蛋白完全變性，置于-20 ℃保存。每孔蛋白上樣量7 ～15 μL，10%SDS-PAGE 電泳分離在電壓80 ～110 V下進行，再以200 mA，90 min的恒流條件轉至甲醇預處理的PVDF 膜上，PBST配制的5%脫脂奶粉中封閉1 h 后，PBST 洗滌3 次，每次10 min，將PVDF 膜放入稀釋后的FBXO7 和GADPH抗體中，4 ℃搖床孵育過夜。次日，PBST 洗滌3 次，每次10 min 后，加入提前稀釋好的二抗中，繼續室溫搖床振蕩孵育1 h。最后PBST 洗滌3 次，每次6 min，再加入現配發光液，置于凝膠成像儀上發光。

1.2.6 細胞增殖實驗將轉染后48 h 的結直腸癌細胞，用胰酶消化離心并計數，以每孔100 μL 細胞懸液（2 000 個/孔）接種到96 孔板中。96 孔板邊緣每孔加入100 μL PBS，以防止蒸發影響實驗結果。分別培養6（當做0 h）、24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，置于37 ℃孵箱中孵育1 h，酶標儀測定波長450 nm 處每孔的OD值。

1.2.7 流式細胞技術檢測細胞周期轉染后48 h的結直腸癌細胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，1 000 r/min 離心3 min 后棄去上清，加入預冷的PBS 洗滌細胞沉淀，再次1 000 r/min 離心3 min 后棄去上清，加入預冷的70%乙醇，吹散細胞，4 ℃冰箱固定24 h。染色前用預冷的PBS 洗滌，加入500 μL Propidium Iodide 溶液，37 ℃避光孵育30 min。上機檢測，分析結果。

1.2.8 細胞劃痕實驗在6 孔板的背面，用Marker筆每隔0.5 ～1 cm 均勻地劃橫線，在每孔中加入5× 105個轉染24 h 后的細胞，培養過夜后使其能鋪滿。第2 天垂直于6 孔板背后的橫線，用10 μL 的槍頭劃痕。PBS 清洗細胞3 遍，洗去劃落的細胞后，加入無血清培養基。放入37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，于0、24、48 h 取樣拍照。

1.3 統計學方法運用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計數資料用均數±標準差表示，t檢驗用于比較兩組間均數。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FBXO7 在結直腸癌細胞中的表達情況通過實時熒光定量PCR 和蛋白免疫印跡檢測結直腸癌細胞中FBXO7 的mRNA 和蛋白表達水平，結果發現HCT116 和SW620 細胞株中FBXO7 的mRNA（P ＜0.05）和蛋白表達量均明顯低于其他細胞株（圖1）。因此選用這兩株細胞進行后續相關實驗。

圖1 熒光定量PCR 和Western blot 法檢測結直腸癌細胞株中FBXO7 表達情況Fig.1 Detection of FBXO7 expression in colorectal cancer cell lines by real-time quantitative PCR and Western blot

2.2 目的基因片段獲取提取結直腸癌細胞中RNA 逆轉錄合成的cDNA，以此為模板進行PCR 擴增。對該擴增產物進行瓊脂糖電泳顯示，在DNA Marker 的1 000 ～2 500 bp 范圍內有一條明顯的條帶（圖2）。本實驗預擴增的FBXO7 全長大小為1 615 bp，該條帶大小與預期的條帶大小相符合，證明FBXO7 片段擴增成功。

圖2 PCR 擴增FBXO7 片段瓊脂糖電泳結果圖Fig.2 PCR amplification of FBXO7 fragment agarose electrophoresis results

2.3 重組質粒的雙酶切鑒定結果對FBXO7 片段和質粒GV230 分別進行限制性內切酶XhoI 和KpnI 雙酶切后連接。將該產物進行細菌轉化，涂板、挑取單個菌落。搖菌并進行質粒小提。經雙酶切后電泳酶切產物，4.7 kb 和1 000 ～2 500 bp 左右分別出現條帶（圖3）。為進一步鑒定質粒，送檢該質粒測序，測序結果經BLAST比對，序列完全正確，從而證明重組質粒GV230-FBXO7構建成功。

圖3 GV230-FBXO7 雙酶切電泳結果圖Fig.3 Results of GV230-FBXO7 double digestion electrophoresis

2.4 轉染GV230-FBXO7 后檢測FBXO7 的表達情況將GV230 和GV230 - FBXO7 質粒分別轉染結直腸癌細胞HCT116 和SW620，檢測結直腸癌細胞中FBXO7 的mRNA 和蛋白表達水平。實時熒光定量PCR 和蛋白免疫印跡檢測結果發現，在兩株細 胞 中，GV230-FBXO7 組FBXO7 的mRNA（P ＜0.05）和蛋白表達量均明顯高于GV230 組（圖4）。該結果證明，GV230-FBXO7 在HCT116 和SW620中均成功過表達。

圖4 熒光定量PCR 和Western blot 法檢測GV230-FBXO7轉染效率Fig.4 Detection of GV230-FBXO7 transfection efficiency by real-time PCR and Western blot

2.5 FBXO7 過表達對結直腸癌細胞體外增殖的影響CCK-8 檢測結果發現，與瞬時轉染的GV230組相比，GV230 - FBXO7組的HCT116 和SW620 細胞在不同時間段OD值均增加（圖5），并且差異有統計學意義（P ＜0.05）。該結果表明，FBXO7 可以增強結直腸癌細胞的體外增殖能力。

2.6 FBXO7 過表達對結直腸癌細胞周期的影響利用流式細胞儀檢測過表達FBXO7 的HCT116 和SW620 細胞周期的變化，結果發現，與GV230 組相比，GV230 - FBXO7 組細胞的G1 期比例減少，而S 期比例增加（圖6），并且差異有統計學意義（P ＜0.05）。由此可見，FBXO7 可以促進結直腸癌細胞由G1 期進入到S 期，促進細胞發生G1/S 期轉變。

圖5 GV230-FBXO7 過表達對結直腸癌細胞HCT116 和SW620 增殖影響Fig.5 Effect of GV230-FBXO7 overexpression on proliferation of rectal cancer cells HCT116 and SW620

2.7 FBXO7 過表達對結直腸癌細胞體外遷移能力的影響通過劃痕實驗檢測過表達FBXO7 后HCT116 和SW620 遷移能力變化，結果顯示，與GV230 組 相 比，GV230-FBXO7 組 的HCT116 和SW620 細胞遷移能力增強，表明過表達FBXO7 后增強了結直腸癌細胞的遷移能力（圖7）。

3 討論

F-box 蛋白家族是泛素化系統的重要組成部分，而F-box 結構域是該家族的標志性結構域，F-box 蛋白通過參與泛素-蛋白酶體途徑進而調控細胞周期、轉錄、信號通路傳導等過程［10-11］。FBOX7 屬于新發現的F-box 蛋白家族的FBXO 類別［12］。研究顯示FBXO7 參與多種疾病的發生發展。FBXO7 突變可以使線粒體功能障礙，這與早發帕金森綜合征密切相關［13］，FBXO7 的丟失會通過RPL23-MDM2-TP53 途徑能導致帕金森氏樣多巴胺變性［14］。FBXO7 和α-突觸素G51D 同時突變可以導致特殊的臨床癥狀，被稱為帕金森-錐體束征［15］。此外，通過依賴p53 的方式，FBXO7 可以負向調節原代造血干細胞（primary hematopietic stem cells，HSPC）的增殖和分化，而當不存在p53 的情況下，FBXO7 表達可促進T 細胞淋巴瘤形成［9，16-17］。此外還有研究發現FBXO7在上皮腫瘤中高表達，在正常組織中不表達或低表達，因此FBXO7 可能具有促進腫瘤發生、發展的作用［18］。

圖6 GV230-FBXO7 對細胞周期的影響Fig.6 Effect of GV230-FBXO7 on cell cycle

圖7 GV230-FBXO7 對細胞遷移能力的影響Fig.7 Effect of GV230-FBXO7 on cell migration ability

腫瘤的發生發展是一個極其復雜的過程，包括體內微環境和細胞的多種遺傳改變［19］。而細胞增殖是所有生物體最重要生理特征之一，也是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎。在一些致癌因素誘導下，細胞增殖失去調控，可導致細胞無限增殖，從而形成腫瘤。因此調控癌細胞的增殖是影響癌癥發生和發展的關鍵。目前，還未有關于FBXO7 參與結直腸癌細胞增殖的相關文獻報道。本實驗中GV230-FBXO7 質粒被成功構建，并驗證了在結直腸癌細胞中的轉染效率。CCK-8 檢測結果發現過表達FBXO7 后可促進結直腸癌細胞體外的增殖。正常細胞周期以有序的方式進行，當調節細胞周期的基因發生突變、缺失和擴增時，細胞周期失去控制，細胞將無限增殖形成腫瘤。為進一步探究FBXO7 在細胞周期中的作用，本實驗通過過表達FBXO7 檢測其對結直腸癌周期的影響，發現G1 期細胞比例減少，而S 期細胞比例增加，表明FBXO7 可以促進結直腸癌細胞由G1 期進入到S期，促進細胞發生G1/S 期轉變，從而影響細胞的增殖能力。文獻報道FBXO7 可以特異性調節Cyclin D1/CDK6 復合物，其過表達能增加Cyclin D1/CDK6復合物和E2F 活性［18］。而細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4 或CDK6 都可以與Cyclin D1 相互作用形成復合物，促進G1 期至S 期的進展［20］，本實驗結果與其較一致。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的最主要的特征。腫瘤細胞轉移取決于其逃離原發腫瘤的能力，通過滲入血管內循環，滲入遠處組織并定植，同時逃避免疫監視并促進局部組織環境變化［21］。腫瘤細胞以不同的模式滲入鄰近的組織基質，如作為單個細胞傳播，稱為“個體細胞遷移”或成片細胞傳播，稱為“集體遷移”［22］。而惡性腫瘤侵襲轉移的最重要標志是突破基膜。MMP-2 和MMP-9屬于MMP 家族，是一種可降解細胞外基質的蛋白水解酶，其異常表達在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用［23］。有文獻報道，F-box 家族中的FBXO22可以增強結直腸癌細胞的侵襲和遷移能力，其作用是通過MMP-2 和MMP-9 實現［24-25］。本實驗在結直腸癌細胞中過表達FBXO7。經細胞劃痕實驗初步發現，過表達FBXO7 后明顯增強了結直腸癌細胞體外遷移能力，具體分子機制有待進一步探討。

綜上所述，FBXO7 不僅可以促進結直腸癌增殖，還能影響結直腸癌細胞周期以及增強結直腸癌細胞體外遷移能力。FBXO7 可能在結直腸癌發生發展的不同階段均發揮著作用，促進結直腸癌的演進。本實驗為深入研究結直腸癌的發生和發展提供了一定的理論依據，進一步明確了FBXO7在結直腸癌中的相關作用，為結直腸癌的治療和預后尋找到新的靶點。然而本實驗還存在一定的局限性，未探究過表達FBXO7 后調控結直腸癌增殖、周期及遷移的具體途徑及通路，并且未進行動物模型實驗驗證。針對本實驗的不足，我們將繼續通過過表達FBXO7 后檢測影響結直腸癌細胞增殖、周期及遷移的相關通路基因及蛋白的表達情況，并通過裸鼠皮下成瘤及肝肺轉移模型來進一步驗證。