二次玻璃化凍融胚胎對臨床妊娠結局的影響

周學亮 毛玉玲 杜紅姿 陳仕萍

廣州醫科大學附屬第三醫院生殖醫學中心（廣州510150）

胚胎的冷凍解凍，可以幫助選擇合適移植胚胎、降低多胎妊娠風險、提高單次取卵的累積妊娠率、減輕促排周期中卵巢過度刺激綜合征（OHSS）患者的反應，在供卵、生育力保存方面有重要意義［1］，已成為生殖中心的常規技術選擇。

胚胎冷凍通常經歷一次凍融即可移植回母體，但也有少數胚胎因特殊情況經歷兩次凍融。同時，隨著囊胚培養技術的不斷發展，以及在臨床的廣泛應用，二次凍融的情況也時有發生，但目前對于胚胎經歷二次凍融，是否會降低胚胎的發育潛能、長期安全性還有待商榷，針對二次凍融對妊娠結局影響的研究較少，盡管有文獻報告一些病例在胚胎二次凍融移植后獲得活產［2-10］，但這些案例數量有限，難以確定其安全性。有研究認為相比單次凍融移植，二次凍融并不影響臨床妊娠率、著床率［10-11］，有類似研究支持上述觀點，二次凍融不影響妊娠率和著床率，但增加流產率［12］。但也有研究發現囊胚二次凍融周期相比單次凍融周期，臨床妊娠率顯著下降，多次凍融影響胚胎發育潛能［12］。二次凍融對胚胎發育潛能以及臨床妊娠結局影響仍存爭議，本研究納入較多（620 例）二次凍融移植周期，較為全面對比雙凍與單凍移植周期，為二次凍融的選擇提供參考。本研究選取在我院進行胚胎二次凍融后移植的患者進行分組分析，以同期隨機選取的非雙凍的解凍胚胎周期患者為對照，研究二次凍融對胚胎發育潛能的影響及探討二次凍融安全性。

1 資料和方法

1.1 一般資料回顧性分析2014年1月至2018年12月在本中心接受解凍囊胚移植周期助孕的患者資料。統計分析二次凍融囊胚組（包括D3 卵裂胚解凍養成囊胚凍回再解凍移植周期和囊胚解凍后凍回再解凍移植周期）和同期單次凍融囊胚的移植周期11 904 例中選取與雙凍周期基本資料匹配的1 250 例作為對照，比較囊胚雙凍組（620例）和單凍組（1 250 例）的臨床妊娠結局和孕產結局（產科結局僅統計2018年8月前移植周期）。所有患者胚胎冷凍、解凍復蘇、囊胚培養及移植均簽署知情同意書。納入標準：（1）取卵周期為常規方案，排除微刺激、PPOS、LPS 方案；（2）冷凍解凍方法為玻璃化冷凍解凍；（3）排除二步移植周期；（4）排除解凍卵子周期；（5）女方年齡≤38 歲。

1.2 方法

1.2.1 卵裂期胚胎冷凍冷凍試劑盒使用日本加藤（KITAZATO）公司產品。挑選符合標準的卵裂期胚胎冷凍，正常受精來源，D3 胚胎細胞數≥5，細胞碎片≤20%，卵裂球大小均一或輕度不均可進行冷凍。將卵裂胚置于ES 液平衡5 ～10 min，后轉移至VS 液平衡45 ～60 s，迅速置于載體，投入液氮。

1.2.2 囊胚冷凍挑選符合形態標準的囊胚冷凍，囊胚分級評分采用Gardner 標準，以數字1 ～6評價囊腔擴張狀態、以字母A/B/C 評價內細胞團和滋養層細胞發育情況，D5 囊胚評分3BB 及以上，D6 囊胚評分為4CB/4BC 及以上進行冷凍。冷凍前激光輔助皺縮囊腔，待囊腔皺縮后置于ES 液平衡2 ～3 min，后轉移至VS 液平衡45 ～60 s，迅速置于載體，投入液氮。

1.2.3 卵裂期胚胎、囊胚復蘇解凍試劑盒使用日本加藤（KITAZATO）公司產品。解凍液WS1 提前分裝到井字皿中央孔，37 ℃不通氣培養箱中預熱，解凍液WS2、WS3、WS4、WS4 按序分裝到四孔板中，平衡至室溫。解凍時將冷凍載體從液氮取出，將裝有載體部分迅速置于WS1 液，輕晃至胚胎脫落，平衡約1 min 后依次轉移至WS2、WS3、WS4、WS4 液，依次平衡3 min。超過50%的卵裂球存活視為卵裂胚復蘇成功。囊胚解凍后培養2 h，囊腔重新擴張至正常形態且內細胞團和滋養層細胞均存活視為囊胚復蘇成功。解凍胚胎培養約2～5 h 后移植。

1.2.4 超排卵方案及受精根據我中心促排方案依患者情況選定，解凍周期凍胚移植內膜準備按本中心臨床技術規范執行。根據取卵日男方精子質量決定行常規體外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞漿內單精子注射術（Intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI），胚胎培養按本中心實驗室技術操作規范（SOP）執行。

1.2.5 移植胚胎及妊娠隨訪胚胎移植，在經腹B 超引導下，將解凍復蘇胚胎移植到患者宮腔中上段，移植后內外管交由實驗室工作人員檢查無胚胎殘留為移植成功。移植后第14 d 進行血清β-HCG 測定，若β-HCG≥25 IU/L，則為生化妊娠。移植后28 d 進行經陰道B 超檢查，若觀察到妊娠囊則為臨床妊娠。此后定期B 超監測隨訪。確認臨床妊娠后，孕12 周內自然流產定義為早期流產，孕28 周內自然流產定義為流產，孕＜37 周分娩定義為早產。體質量＜2 500 g 定義為為低出生體重兒，＜1 500 g 定義為極低出生體重兒。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0 進行數據處理，呈正態分布數據以均數± 標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗；非正態分布數據采用M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney′sU檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料對比兩組的基線特征，單凍組和雙凍組的女方平均年齡、平均移植胚胎個數、體質量指數、內膜厚度、不孕年限、不孕類型、復蘇周期內膜準備方式、內膜轉化日內膜厚度差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 解凍移植周期患者的基線特征Tab.1 Baseline characteristics of patients in vitrified-warmed embryo transfer 例（%）

2.2 解凍存活比較單凍組和雙凍組囊胚解凍存活率分別為98.8%、98.8%，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。囊胚行輔助孵化率分別為9.0%、8.2%，組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 臨床和孕產結局比較比較兩組臨床結局，單凍組和雙凍組間多胎率、單卵雙胎率、早期流產率、流產率、異位妊娠率差異無統計學意義（P＞0.05，表2）；雙凍組胚胎著床率（36.9%）顯著低于單凍組（50.1%），差異有統計學意義（P＜0.05）；臨床妊娠率（43.1%）顯著低于單凍組（62.8%），差異有統計學意義（P＜0.05）。對比兩組活產結局、早產率、活產率、死產率、平均孕周、出生嬰兒平均體質量組間差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表2 解凍移植周期的臨床妊娠結局對比Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes in vitrified-warmed embryo transfer 例（%）

表3 解凍移植周期的嬰兒孕產對比Tab.3 Comparison of infant outcomes in vitrified-warmed embryo transfer 例（%）

3 討論

胚胎冷凍技術是輔助生殖技術（ART）技術的重要組成部分，由于操作簡便、胚胎復蘇率高、臨床妊娠率高等優點［12］，越來越多生殖中心采用玻璃化冷凍胚胎技術。胚胎在凍融過程中會發生冰晶應力、冷休克、溶質效應、破碎效應、重結晶和滲透性休克等冷凍損傷［16］。玻璃化冷凍液含有冷凍保護劑的高滲溶液，常用冷凍劑包括乙二醇、丙二醇、DMSO 和非滲透性保護劑（蔗糖、聚蔗糖等），如DMSO 毒性較高，會與蛋白發生不可逆結合，易導致果糖-1，6-二磷酸酶的功能受損，對細胞產生毒性作用。此外冷凍過程中，隨著胞外冰晶的形成，滲透壓升高，溶液其他的理化參數如氣體溶解指數、黏滯度和pH 等也會發生改變，偏離細胞的生理環境，加重對細胞的損傷。冷凍過程減少冰晶形成尤為重要，在胚胎冷凍降溫過程中水會形成冰晶，體積增大破壞細胞骨架結構，改變膜通透性，損傷細胞甚至導致細胞死亡［17-18］。

玻璃化冷凍技術日趨成熟，對卵母細胞［19-20］、卵裂期胚胎、囊胚［21］、卵巢組織［22-23］凍融復蘇均取得不錯的效果，胚胎復蘇存活率可以達到90%以上，被廣泛應用于生殖領域。同時，安全性也一直是人們所關注的重點。有研究對比新鮮胚胎移植周期和解凍胚胎移植周期，發現解凍周期的著床率和臨床妊娠率顯著高于新鮮移植組［24］。也有研究聯合多中心隨機對照研究顯示，與新鮮單囊胚移植比較，全胚冷凍后解凍周期行解凍復蘇單囊胚移植可顯著提高胚胎著床率、臨床妊娠率及活產率，以及單胎新生兒出生體質量，而流產率、其他產科并發癥及新生兒發病率與之相似，但同時發現冷凍復蘇單囊胚移植的母親子癇前期風險增加［25］。有Meta 分析發現，解凍周期單胎妊娠的圍產風險低于新鮮胚胎移植周期，包括低胎齡兒、低出生體重兒、早產、產前出血、圍產期死亡率等風險［26-27］。胚胎的成功著床不僅需要高質量的胚胎，也需要胚胎與子宮內膜的相互作用［28］，解凍周期患者胚胎表現出更好的容受性，與胚胎發育同步性提高，臨床結局更好。

冷凍胚胎通常經歷單次凍融即可移植，但隨著輔助生殖治療技術的不斷進步，臨床上逐漸出現二次凍融的囊胚，如：有患者移植當日遇突發因素無法移植，此時胚胎已解凍復蘇需二次凍回，待下個解凍周期再復蘇移植，即胚胎在被移植前經歷兩次冷凍、復蘇過程，成為雙凍胚胎。隨著二胎的放開，越來越多曾接受過輔助生殖治療并有剩余胚胎保存的患者回來接受解凍移植周期治療，這其中有很多胚胎可能是五六年前甚至十幾年前儲存的胚胎，當患者剩余胚胎數目足夠的情況下（≥3 個），患者經常會選擇進行囊胚培養后移植，部分患者移植囊胚后仍有多余的囊胚會被凍回，成為雙凍囊胚。有研究發現相比卵裂胚移植，單優囊胚移植顯著提高臨床妊娠率、種植率，降低多胎率［29］，近年來，減少輔助生殖治療中多胎妊娠、降低孕產并發癥風險，逐漸成為學者關注的重點。在患者條件及胚胎質量適合的情況下，單囊胚移植便成為優先選擇或必要選擇。尤其在生育二胎的患者中，有很大一部分患者首胎生產方式為剖宮產，這類患者一般會建議選擇單胚移植，但此時患者的胚胎往往并非單枚冷凍，在復蘇培養移植單囊胚后，剩余一枚凍回囊胚成為雙凍囊胚。

目前關于二次玻璃化凍融胚胎安全性研究較少，有研究回顧分析34 例二次凍融周期與同期隨機選擇的71 例常規單次凍融周期相比較，統計分析發現二次凍融組著床率、臨床妊娠率均顯著低于單次凍融組，兩組的流產率、多胎率、新生兒產科結局比較差異無統計學意義［13］。也有報道患者移植玻璃化雙凍胚胎后產下健康胎兒，記錄女嬰體況并隨訪至12 歲，身體和智力發育均正常［30］。二次凍融胚胎對臨床妊娠、新生兒結局影響仍存在爭議，本文旨在探討分析二次凍融對胚胎發育潛能的影響及探討二次凍融安全性。

本研究對比單凍組和雙凍組囊胚移植妊娠結局，發現多胎妊娠率、單卵雙胎率、早期流產率、流產率和異位妊娠率組間差異無統計學意義（P＞0.05），而著床率、臨床妊娠率顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），與以前研究結果［30］相似，但與另一研究結果［12］有差別，該研究是解凍慢速冷凍D3 凍卵裂期胚胎，與本研究玻璃化解凍D3 胚胎可能對臨床妊娠有不同影響。對比兩組的新生兒活產情況，早產率、活產率、死產率、分娩孕周和新生兒出生體質量組間差異無統計學意義（P＞0.05），與以前的相關研究結果類似。筆者認為雙凍組比單凍組著床率、臨床妊娠率顯著降低，可能與雙凍組的囊胚經過兩次玻璃化凍融、冷凍過程中的冷凍損傷、吹吸胚胎的機械損傷、冷凍過程透明帶的脫落使囊胚暴露在外界環境等因素對胚胎發育潛能的損害相關。

單囊胚移植是目前國際輔助生殖發展的趨勢，它在保證一定妊娠率的同時，極大的降低了多胎率，本中心對符合Day3 可用胚胎數量和質量標準的患者，建議其養成囊胚后再行單囊胚冷凍或移植，盡量避免囊胚雙次凍融的發生。

本研究對比雙次凍融和單次凍融囊胚移植周期，為雙凍囊胚研究提供參考。綜上所述，二次凍融在一定程度上會降低囊胚的種植率，但仍有較高的著床妊娠能力，對于雙凍囊胚移植仍有43.1%的妊娠率。同時，雙凍并未提高如流產、多胎等不良妊娠結局。對于復蘇卵裂胚有特殊意外因素不能及時移植的患者，可考慮進行囊胚培養后再進行移植或冷凍。但囊胚培養存在未形成可用囊胚的風險，各中心應根據實際情況，進行選擇。本研究探究二次玻璃化冷凍對胚胎發育潛能的影響，為今后胚胎冷凍損傷提供參考。