納米零價鐵降解水中17β-雌二醇的作用機制

楊碩，余薇薇，楊倫，杜邦昊，謝明原，趙晨菊，萬巧玲，潘偉亮

（1 重慶交通大學河海學院，水利水運工程教育部重點實驗室，重慶400074；2 國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)重慶監(jiān)測站，重慶400060）

隨著中國城市化進程和規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，大量天然類固醇雌激素（NSE）通過污水處理廠、養(yǎng)殖廢水排放和沼液灌溉進入周邊水體和土壤[1-2]，給自然環(huán)境帶來嚴重威脅。NSE主要包括雌酮（E1）、17β-雌二醇（17β-E2）、17α-雌二醇（17α-E2）和雌三醇（E3）。因具有強烈的內(nèi)分泌干擾性，傳統(tǒng)污水處理工藝降解效果有限[3]，NSE的有效降解已成為世界各國研究的重要環(huán)境課題之一。其中17β-E2 具有雌激素活性最高、穩(wěn)定性較強、自然水體中廣泛檢出等特點[4]，環(huán)境危害性最大。近年研究表明，我國長江、珠江等主要地表水體中17β-E2 和E1（17β-E2 主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物）均有較高檢出率和檢出濃度[5-6]。

目前，光催化氧化[7]、微生物降解[8]、碳納米管吸附降解[9]等方法被相繼用于降解NSE。然而大多數(shù)方法僅能在污水處理單元中發(fā)揮作用，難以用于NSE 污染水體的修復。納米零價鐵（nZVI）作為一種廣泛應用于水體及土壤修復的納米材料，因其納米尺寸、高比表面積、高活性、低制備成本和低環(huán)境危害性等特點[10]，被認為是有機污染物污染水體修復的理想材料。近年來，已有關于nZVI 降解NSE的報道，其中Ali等[11]研究了nZVI對17β-E2的吸附機理；Jarosova等[12]驗證了nZVI降解17β-E2的可行性。然而針對nZVI 降解NSE 的作用機制及其作用下NSE降解路徑尚不明確。

1 實驗材料和方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器： 島津三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（Shimadzu LC-MS/MS-8060）、日立高效液相色譜（Chromaster 5100，Hitachi）、UV-Vis 分光光度計（HACH DR6000）、場發(fā)射掃描電鏡（JEOL，JSM-7800F）、X 射線衍射儀（Rigaku Ultima Ⅳ）、電鏡能譜儀（ZEISS JSM-6360LV）、12位固相萃取裝置（Mediwax-12）、水浴氮吹儀（MTN-2800W-12）、渦旋混勻器（VORTEX-5）等。

試劑：雌酮（E1，純度≥99%）、17α-雌二醇（17α-E2，純度≥98%）、17β-雌二醇（17β-E2，純度≥99%）、雌三醇（E3，純度≥98.5%）均購于北京百靈威（J&K）科技有限公司；氘代雌酮（E1-d4，純度≥99.5%）購于加拿大CDN 同位素公司；納米零價鐵（nZVI，純度＞95%，平均粒徑80nm）購于上海阿拉丁生物科技有限公司。甲醇、乙腈、異丙醇、三氯甲烷等均為HPLC 級。鹽酸、氫氧化鈉、乙酸銨等均為分析級。

材料：NH2固相萃取柱（Welchrom? 6cc/500mg）、高純度氮氣（純度≥99.999%）、自動進樣器及柱轉(zhuǎn)換接頭等。

1.2 實驗方法

試驗后使用高強度釹鐵硼（NdFeB）磁體在氮氣保護下加速nZVI的沉積，沉積物在氮氣保護下干燥并用2mL甲醇淋洗3次后放入充滿氮氣的玻璃樣品瓶。應用XRD及FESEM表征nZVI反應前后的變化。

1.3 檢測方法

17β -E2 濃 度 檢 測 應 用 帶 有C18色 譜 柱（4.6×150mm，5μm）的高效液相色譜儀，流速1.0mL/min，流動相為45%乙腈和55%超純水，201nm 波長紫外條件。17β-E2 標準曲線呈線性關系（R2＞0.999）。

鄰菲羅啉分光光度法[13]改進后用于Fe2+濃度測量。0.5mL 樣品過0.22μm 尼龍膜，濾液顯色后在510nm 下測量吸光度。Fe2+標準曲線的檢測范圍為0.02～5.00mg/L（R2＞0.999）。

應用高效液相色譜串聯(lián)兩級質(zhì)譜儀（HPLCMS/MS）鑒定17β-E2 可能的降解產(chǎn)物。設兩組重復試驗，量取50mL 樣品過膜后通過NH2固相萃取柱濃縮純化。活化液為5mL 甲醇和5mL 超純水，洗脫液為5mL 甲醇/乙酸乙酯（體積比1/1）和5mL 5%氨水甲醇溶液，水浴氮吹后2mL 甲醇重溶解。在ESI(-)模式下分析產(chǎn)物，掃描范圍m/z=50～1200，詳細參數(shù)見表1。17β-E2、17α-E2、E1、E3標準曲線均呈線性關系（R2＞0.999），LC-MS/MS檢測檢出限（LOD）范圍為0.07～0.39ng/L，定量限（LOQ）范圍為0.24～1.18ng/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 17β-E2降解動力學

通過IBM SPSS 25 和Origin 2018 進行偽一級動力學擬合，改進的擬合公式[14]如式(1)所示。

表1 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀分析參數(shù)

式中，R 為t 時刻17β-E2 的降解率，即R=Ct/C0；Rmax為反應器中17β-E2的理論最大降解率，即Rmax=Cmax/C0；k為擬合的一階速率常數(shù)，min-1。

擬合的偽一級動力學曲線如圖1所示，相關系數(shù)（R2）大于0.95（p＜0.01）。說明模型對17β-E2的降解過程擬合良好，可用于評估nZVI對17β-E2的降解動力學。

圖1 不同pH下nZVI降解17β-E2動力學曲線

nZVI 對17β-E2 的降解效率在pH=5 和3 時較高，分別為84.72%±2.74%和92.3%±4.55%（圖2）。總體上，nZVI 在酸性條件（pH=3,5）下可高效降解17β-E2，而中性條件（pH=7）時效率較低，為11.41%±1.25%。

清除實驗中，pH=7 時17β-E2 降解率僅為5.47%±0.19%［圖1(a)］，結(jié)合能譜分析結(jié)果（后文2.4節(jié)）說明該降解體系中17β-E2的降解主要依賴降解而非吸附作用。pH 從5 上升到7 時，體系中17β-E2 的降解率大幅下降。這是由于高pH（pH＞6）時，nZVI在溶解氧和OH-的作用下［式(2)］表面被致密的鈍化膜、鐵離子水解產(chǎn)物和其他沉淀物覆蓋，活性點位減少，材料與污染物的接觸受到限制，從而導致其降解性能的下降[15-17]。而圖3中，pH=7時Fe2+濃度的快速下降至趨于0也證實了體系中離子水解的存在。相比之下，pH從5下降到3時降解率僅有小幅上升。較低pH時，體系中17β-E2的降解呈現(xiàn)一定程度抑制的現(xiàn)象，一方面歸結(jié)于nZVI過快的酸腐蝕不利于H2O2的生成［式(3)］，另一方面體系中產(chǎn)生的氫（H2）在nZVI 表面形成密集的微小氣泡［式(6)］，阻礙nZVI 在低pH 條件時的反應[18]。雖然pH=3時17β-E2的降解率受一定影響，但其降解速率卻大幅提升（表2）。這是由于酸性條件下Fe2+的加速產(chǎn)生，進一步加速ROS的生成［式(4)、式(5)］。且H+在nZVI 作用下轉(zhuǎn)化為H2的過程中可能導致更多活性氫原子（[H]）的生成[19]［式(6)］，從而加快反應速度。在nZVI/H2O2降解諾氟沙星報道中[20]，也發(fā)現(xiàn)了低pH 下存在類似趨勢。

2.2 ?OH和的貢獻

圖2 反應90min后不同pH下17β-E2降解率

表2 降解及清除動力學曲線擬合數(shù)據(jù)

圖3 不同pH下nZVI降解17β-E2過程中Fe2+濃度

2.3 nZVI的腐蝕及Fe2+的產(chǎn)生

對降解實驗和清除實驗中Fe2+濃度進行連續(xù)監(jiān)測，以評估體系中nZVI腐蝕情況對17β-E2降解的影響（圖3）。pH=7 時，反應前期Fe2+濃度少量增加后迅速下降至趨近于零，證實了中性條件下17β-E2的降解被nZVI 的表面鈍化所阻。pH=5時，F(xiàn)e2+濃度先快速升高后緩慢降低至平衡，且最高濃度僅有pH=3時的61.61%±0.002%。這是因為pH＞4時，酸性條件對nZVI 表面氧化膜的抑制作用［式(9)］降低，氧化膜限制Fe2+的產(chǎn)生；另一方面，F(xiàn)e(OH)3的生成［式(10)］在消耗Fe2+的同時促進Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)化。pH=3時，F(xiàn)e2+濃度在前15min內(nèi)快速增加后趨于穩(wěn)定，與17β-E2 在前15min 的快速降解一致；15min 后，F(xiàn)e0向Fe2+的轉(zhuǎn)化以及Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)化達到動態(tài)平衡，17β-E2 的降解速率降低并趨于平衡。總體上，17β-E2 的降解率和降解速率和Fe2+的濃度和生成速度相關[24]。

清除實驗中，F(xiàn)e2+濃度均略低于降解實驗，這是因為?OH和?O2-被捕獲后促進了式(4)和式(5)的反應平衡向生成Fe3+的方向移動，而非淬滅劑和Fe2+的直接作用。清除和降解實驗反應0～40min 階段Fe2+的濃度差值較大，從而表明pH=5時17β-E2 較高的降解率主要依賴于Fe2+引導的Fenton反應。

2.4 反應前后nZVI表征

對反應前后的nZVI 進行EDS 表征結(jié)果見表3，實驗中使用的nZVI 含有微量的Cu 和C，為液相還原法制備。反應后，樣品中出現(xiàn)了Cl，C含量的增加，說明nZVI 對氯仿等有機物有少量吸附。當nZVI 投加量大于0.4g/L 時開始表現(xiàn)對NSEs 的降解[11]，大于1g/L時表現(xiàn)出對NSEs的明顯吸附[12]，而實驗所用0.5g/L nZVI 對17β-E2 的降解以降解為主。

對nZVI 反應前后的XRD 表征見圖4，分析表明實驗所用nZVI 為體心立方結(jié)構(gòu)，反應后僅觀察到微弱的FeO峰，且存在許多細小雜峰。微弱的氧化峰，可能因為nZVI 表面致密的鈍化膜阻止了其進一步氧化。對XRD 進行全譜擬合，nZVI 平均粒徑計算為80nm，反應后nZVI 的平均粒徑大于100nm 且晶面間距減小，表明反應后nZVI 顆粒發(fā)生了一定的磁性聚集。

圖4 反應前后nZVI的XRD圖譜

表3 反應前后nZVI能譜檢測數(shù)據(jù)

圖5 反應前后nZVI的掃描電鏡圖

應用FESEM 對反應后nZVI 的形貌變化進行表征（圖5），放大5 萬和10 萬倍觀察nZVI 的形貌特征。nZVI 顆粒呈規(guī)則的球形，平均粒徑在80～100nm之間，材料呈現(xiàn)簇狀聚集但分散性良好。反應后，nZVI的球形結(jié)構(gòu)因腐蝕和氧化作用而坍塌，顆粒呈明顯的聚集，并產(chǎn)生鱗片狀和棱錐狀結(jié)構(gòu)[26]。這說明nZVI可通過自身腐蝕產(chǎn)生Fe2+等進一步誘導產(chǎn)生ROS，其降解污染物的能力受鈍化和磁性聚集所限制。

2.5 17β-E2降解產(chǎn)物和路徑分析

通過貝農(nóng)表-相對豐度法分析降解產(chǎn)物可能的分子結(jié)構(gòu)[27]。3 種已知轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（E1、17α-E2 和E3）可定量分析（表4），其中17α-E2、E3均未檢出，說明17β-E2 的D 環(huán)除了C17 處的羥基易轉(zhuǎn)化為酮基外相對穩(wěn)定（圖6）。在所有實驗中E1 均有檢出，濃度見表4，表明17β-E2 易被nZVI 轉(zhuǎn)化為E1，而自然條件下E1 也是17β-E2 的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[1,28]。隨著pH值的降低，E1的產(chǎn)率降低，說明轉(zhuǎn)化生成的E1 可在較低pH 值下被nZVI 進一步降解。

表4 3種已知轉(zhuǎn)化產(chǎn)物定量濃度

圖6 類固醇雌激素分子結(jié)構(gòu)

pH=7 時，檢測到負離子碎片m/z=255（MW=256，C18H24O）、m/z=273 （MW=274，C18H26O2）、m/z=289 （MW=290，C18H26O3）、m/z=293 （MW=294，C18H30O3）和m/z=307（MW=308，C18H28O4），可能的降解路徑如圖7所示。

圖7 不同（pH=3、5、7）時17β-E2可能的降解路徑

17β-E2轉(zhuǎn)化為E1后未檢測到進一步的降解產(chǎn)物。17β-E2 的主要降解路徑為A 環(huán)基團的替換、斷裂和開環(huán)。Du 等[29]通過軟件計算17β-E2 的Fukui指數(shù)，得出17β-E2 A環(huán)的C2和C4位具有最高的Fukui 指數(shù)（0.102 和0.101），而高的Fukui 指數(shù)表明它們相較其他點位更易失去電子，被·OH和?O2-等強親電子基團取代[30]。17β-E2可能的降解路徑為A環(huán)（芳香環(huán)）失去電子（MW=284），羥基或酮基取代（MW=290），A環(huán)的開環(huán)（MW=308）以及脫羥基（MW=294）。

pH=3 和5 時，未檢測到到負離子碎片m/z=293，新檢出m/z=285（MW=86，C18H22O3）、m/z=303（MW=304，C18H24O4）、m/z=541（MW=542，C36H46O4）和m/z=811（MW=812，C54H68O6），可能的降解路徑如圖7所示。

17β-E2轉(zhuǎn)化為E1后在酸性條件下可被進一步降解，其可能的降解路徑為A 環(huán)的羥基取代和開環(huán)。自然條件下，E1（19h）與17β-E2（13h）相比半衰期更長，因此更穩(wěn)定[31]。當pH 升高，ROS產(chǎn)率下降時，ROS優(yōu)先攻擊相對不穩(wěn)定的17β-E2。pH=3 時，新檢出m/z=249（MW=250，C17H30O）和m/z=279（MW=280，C18H32O2）。在低pH 時，17β-2E A 環(huán)開環(huán)后可進一步降解，表現(xiàn)為脫羥基及A環(huán)的徹底斷裂。此外不排除17β-E2 在Fenton 反應作用下徹底礦化的可能[32]。

由圖7 可知，產(chǎn)物17β-E2 二聚體和三聚體表明nZVI 體系在酸性條件下可進行仿漆酶反應，將底物活化為有機自由基進行自由基偶聯(lián)或相互共價偶聯(lián)[33]。而17β-E2 二聚體最有可能在C2-C4'，C4-C2'和C2-C2'之間偶聯(lián)，三聚體則最有可能在C4-C2'，C2-C2'和C2-C2'，C4-C4'之間偶聯(lián)[34]。

3 結(jié)論

酸性條件下，17β-E2可被nZVI迅速降解；而中性條件下，鈍化膜和鐵離子的水解產(chǎn)物包裹nZVI 表面，限制其降解污染物能力。17β-E2的降解率和降解速率與Fe2+濃度及生成速度呈正相關。Fe2+主導的Fenton 反應在nZVI 體系中占有重要地位。