發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的快速估測方法

宋 磊,劉苗苗,郭燕風(fēng),王宜磊,*

(1.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,山東菏澤 274000;2.山東丹紅制藥有限公司,山東菏澤 274000)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是一種高分子酸性黏多糖,由N-乙酰葡萄糖胺與葡萄糖醛酸通過β-l,4和β-l,3糖苷鍵反復(fù)交替連接而成[1]。由于其獨特的流變學(xué)特性、黏彈性、保濕性及良好的生物相容性,在食品、化妝品、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[2-5]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸相對于從動物組織中提取具有周期短、產(chǎn)量高,環(huán)境友好等優(yōu)點,是目前最主要生產(chǎn)方法[6-9]。

發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量檢測多采用Bitter-Muir法[10-13],該方法步驟繁瑣,檢測時間長,誤差大;從取樣到檢測出結(jié)果至少需要3 h。微生物發(fā)酵周期一般不超過20 h,發(fā)酵高峰期只有7～9 h,利用該方法實時監(jiān)測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量及判定發(fā)酵終止時間沒有太大指導(dǎo)意義。陳永浩等[14]提出CTAB比濁法快速測定搖瓶發(fā)酵液液中透明質(zhì)酸,利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液與HA溶液反應(yīng)產(chǎn)生混濁的特性,通過反應(yīng)體系的吸光度來反映其濁度,進(jìn)而通過濁度與HA濃度的線性相關(guān)性估測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量。這種方法雖然在一定程度上減少了估測時間,但該方法研究取得的數(shù)據(jù)分析是基于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),搖瓶發(fā)酵液受限于底物添加量、溶氧、pH持續(xù)降低等因素,透明質(zhì)酸含量、菌體量、粘度等參數(shù)與工業(yè)生產(chǎn)有較大差距,因此利用此方法對企業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)發(fā)酵過程中透明質(zhì)酸含量估測不太準(zhǔn)確。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),未見有對發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液狀態(tài)參數(shù)相偶聯(lián),通過快速檢測狀態(tài)參數(shù)而快速估測透明質(zhì)酸含量相關(guān)報道。陳莉等[15]提出了基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)快速估測發(fā)酵液中羊肚菌胞外多糖的含量;劉靜等[16]通過測定水溶液中濁度快速估測出水中殼聚糖含量,均取得了有益的研究經(jīng)驗。

本文結(jié)合工廠實際生產(chǎn)經(jīng)驗,通過對透明質(zhì)酸液體深層發(fā)酵過程中透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵過程中幾個重要參數(shù)的相關(guān)性及變化規(guī)律分析,構(gòu)建數(shù)學(xué)模型,以期能達(dá)到快速估測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵液 山東某生物工程公司提供;咔唑、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司;硫酸、氫氧化鈉 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖醛酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PL203/01型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DV2TRV型旋轉(zhuǎn)粘度計 美國博勒飛(廣州)有限公司;WGZ-200型濁度儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司;HK338電導(dǎo)率儀 北京華科儀科技有限公司;UV5800型分光光度計 上海元析儀器有限公司;H1650型離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;DZF6090型真空干燥箱 上海皓莊儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液取樣 透明質(zhì)酸發(fā)酵周期短,發(fā)酵過程中各參數(shù)變化快。選定從發(fā)酵開始,間隔2 h取樣;取2019030901、2019031503、2019040201、2019060402、2019060501、2019060602六個發(fā)酵批次同一發(fā)酵時間節(jié)點發(fā)酵液300 mL,檢測其中透明質(zhì)酸、菌體量、濁度、粘度、電導(dǎo)率、殘余糖含量。

1.2.2 菌體生長曲線及透明質(zhì)酸含量變化曲線繪制 對上述六個批次同一時間節(jié)點測得菌體量、透明質(zhì)酸含量取平均值,繪制曲線。

1.2.3 透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液中各指標(biāo)相關(guān)性分析 對上述六個批次同一時間節(jié)點測得透明質(zhì)酸含量、菌體量、濁度、電導(dǎo)率、粘度、殘余糖含量取均值,利用軟件繪制發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與其他各參數(shù)相關(guān)性散點圖,并根據(jù)分析結(jié)果,考察其相關(guān)性。

1.2.4 構(gòu)建數(shù)學(xué)模型 篩選出與發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量變化規(guī)律相關(guān)性顯著參數(shù),構(gòu)建一元線性模型、二次項曲線模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,用于預(yù)測未知發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量。

1.2.5 三種數(shù)學(xué)模型預(yù)測效果比較 對2020030101、2020030203其他兩個批次22個發(fā)酵液樣品中透明質(zhì)酸含量及相關(guān)性顯著參數(shù)含量測定;利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)據(jù)處理方法獲得數(shù)學(xué)模型對發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量進(jìn)行估測;將實測值與模型估測值進(jìn)行對比,依據(jù)試驗樣本方差作為3種模型的評價指標(biāo)用于檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性。方差計算公式

式中:S2表示方差;Y1表示數(shù)學(xué)模型計算值,g/L;Y2表示試驗測得實測值,g/L。

1.2.6 發(fā)酵過程中各指標(biāo)測定方法

1.2.6.1 發(fā)酵液中透明質(zhì)酸提取純化方法 將100 mL發(fā)酵液加入其2倍體積的酒精中,室溫下攪拌后靜置30 min,5400×g離心10 min,棄上清液,加400 mL純凈水溶解,升溫至60 ℃,加氯化鈉12 g,EDTA二鈉1 g,用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至9.6,靜置30 min,過濾至澄清度≥99.5,即得供試樣品液。

1.2.6.2 發(fā)酵液中還原糖的測定 采用DNS法[17-18],稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶于少量蒸餾水中,加入2 mol/L氫氧化鈉溶液262 mL,再加入185 g酒石酸鈉鉀、5 g結(jié)晶酚、5 g亞硫酸鈉,搖勻,冷卻后定容至1000 mL棕色容量瓶中,于4 ℃冰箱中放置7 d備用。精密量取1.14 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6個20 mL具塞試管中,補(bǔ)充蒸餾水至2 mL混勻,加入1.5 mL DNS試液,搖勻后置沸水浴保持5 min,冷卻至室溫,定容至刻度,搖勻。同時,以水為空白管對照,采用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取透明質(zhì)酸發(fā)酵液加純凈水適當(dāng)稀釋后,取溶液1.0 mL置于20 mL具塞試管中,按照上述方法測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算供試品中還原糖的含量。

1.2.6.3 透明質(zhì)酸測定 采用Bitter-Muir法[10-13],精密量取100 μg/mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于20 mL具塞試管中,各加水至1.0 mL,混勻,冰浴中冷卻,并在不斷攪拌下緩緩加入硼砂硫酸溶液5.0 mL,密塞,沸水浴中加熱10 min,放冷。精密加入咔唑溶液0.2 mL,搖勻,沸水浴中加熱15 min,放冷。在530 nm波長處測定吸光度,以葡萄糖醛酸對應(yīng)的吸光度計算回歸方程(回歸相關(guān)系數(shù)>0.999)。精密量取供試品溶液1.0 mL置于具塞試管中,按照上述方法,測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖醛酸含量。根據(jù)理論計算,HA分子中葡萄糖醛酸的含量為46.32%,故可根據(jù)葡萄糖醛酸含量除以46.32%即得HA含量。

1.2.6.4 發(fā)酵液粘度測定 采用數(shù)顯旋轉(zhuǎn)粘度計測定:控溫25 ℃,根據(jù)不同粘度,選擇合適轉(zhuǎn)子及轉(zhuǎn)速測定讀數(shù)。

1.2.6.5 電導(dǎo)率 控溫25 ℃,采用電導(dǎo)率儀測定。

1.2.6.6 濁度 對發(fā)酵液稀釋10倍后,采用濁度儀測定。

1.2.6.7 發(fā)酵液中菌體含量的測定 采取干重法[19],根據(jù)透明質(zhì)酸發(fā)酵液粘度液稀釋至1000 mPa·s以下后離心取沉淀,洗滌一次,60 ℃真空干燥至恒重,稱取質(zhì)量計算細(xì)胞濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計;SPSS 19.0軟件用于相關(guān)性分析、偏相關(guān)分析、一元線性模型及二次項曲線模型構(gòu)建;Matlab2014軟件用于構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型;采用Orgin 9.1軟件進(jìn)行繪圖。對六個批次發(fā)酵液測得各參數(shù)數(shù)據(jù)取均值用于相關(guān)性分析;六個批次各參數(shù)測得全部數(shù)據(jù)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長曲線及透明質(zhì)酸含量變化曲線

對六個批次同一時間節(jié)點測得菌體量、透明質(zhì)酸含量值取平均值,繪制曲線。結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 菌體生長曲線

圖2 透明質(zhì)酸含量變化曲線

從圖1可知,0～2 h為菌體生長的調(diào)整期,菌體量很少;2～10 h為對數(shù)生長期,菌體快速生長繁殖;10～18 h菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體量始終保持在高位;18 h后進(jìn)入衰亡期,菌體開始自溶。從圖2可以看出,0～6 h透明質(zhì)酸產(chǎn)量很少;6～16 h透明質(zhì)酸快速積累;18 h后細(xì)胞生長進(jìn)入衰亡期,菌體開始裂解,逐漸釋放透明質(zhì)酸酶,致使透明質(zhì)酸開始降解,產(chǎn)量下降。

2.2 透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液各參數(shù)相關(guān)性分析

由圖3可以直觀地看出,發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與還原糖含量、粘度相關(guān)、菌體量存在一定相關(guān)性,與電導(dǎo)率、濁度相關(guān)性不顯著。經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗分析,表1給出了透明質(zhì)酸含量與菌體量、濁度、粘度、電導(dǎo)率、殘余還原糖含量各參數(shù)之間的相關(guān)性系數(shù)及檢驗顯著性水平。發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液濁度、電導(dǎo)率相關(guān)顯著性水平分別為0.081、0.192,均大于0.05,表明發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液濁度、電導(dǎo)率變化不存在相關(guān)性;發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液中菌體量、粘度、殘余還原糖變化顯著性水平分別為0.001、0.000、0.000,遠(yuǎn)小于0.05,表明發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與發(fā)酵液中菌體量、粘度、殘余還原糖顯著性相關(guān)。

表1 透明質(zhì)酸(HA)與各參數(shù)相關(guān)系數(shù)及顯著性水平

圖3 透明質(zhì)酸(HA)與各參數(shù)相關(guān)性散點圖

單純利用相關(guān)系數(shù)來評價變量間的相關(guān)性還不夠準(zhǔn)確,還需要在剔除其他相關(guān)因素影響的條件下,計算變量間的偏相關(guān)系數(shù)[15]。經(jīng)偏相關(guān)分析,結(jié)果見表2。控制粘度及殘余還原糖含量兩個變量,透明質(zhì)酸含量與菌體量相關(guān)性系數(shù)為0.137,顯著性水平為0.725,遠(yuǎn)大于0.05,表明兩者存在虛假性相關(guān)。控制其他兩個變量,透明質(zhì)酸含量與粘度、殘余還原糖變化規(guī)律呈顯著性相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.984、-0.869,顯著性水平均小于0.01。這是由于發(fā)酵液中葡萄糖除了少部分用于菌體生長繁殖外,絕大部分用于合成透明質(zhì)酸。其流程是葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP)途徑形成6-磷酸果糖,然后在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺,進(jìn)而合成交替地將尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖;尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸是通過糖醛酸途徑合成。菌體中透明質(zhì)酸分子鏈的延長是從內(nèi)源非還原端進(jìn)行,透明質(zhì)酸合成酶交替地將尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分鐘約100個糖單位的速度快速添加到HA分子鏈上,同時逐漸增長的HA鏈會穿過質(zhì)膜被送到胞外基質(zhì)中[20]。故發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與還原糖含量變化表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性;透明質(zhì)酸水溶液由于其分子內(nèi)和分子間的作用,具有非牛頓流體的流變學(xué)特性及粘彈性。當(dāng)透明質(zhì)酸的濃度較低,溶液的粘度隨濃度變化相對較小,但濃度達(dá)到某一閾值時,溶液的粘度隨濃度的增加而快速提高,并表現(xiàn)出很強(qiáng)的的正相關(guān)性。結(jié)合兩變量相關(guān)性及偏相關(guān)分析,可用發(fā)酵液粘度與發(fā)酵液中殘余還原糖來描述預(yù)測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量,其中透明質(zhì)酸與發(fā)酵液粘度在相關(guān)性與偏相關(guān)性更強(qiáng),顯著性水平更低;此外考慮到發(fā)酵液粘度檢測可通過旋轉(zhuǎn)粘度計直接讀數(shù),方法簡單;發(fā)酵液中還原糖含量檢測步驟繁瑣、時間長情況,選定發(fā)酵液粘度最為描述發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量變化的唯一變量。

表2 透明質(zhì)酸(HA)與各參數(shù)的偏相關(guān)系數(shù)

2.3 構(gòu)建數(shù)學(xué)模型

取六個發(fā)酵批次66組實驗數(shù)據(jù)用于數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建,采用SPSS 19.0進(jìn)行一元線性回歸和二項式曲線回歸分析;matlab2014構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。公式中Y代表發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量,X代表粘度。

2.3.1 一元線性回歸 對33組試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行一元線性回歸分析。結(jié)果如下:

Y=0.641+0.076X

經(jīng)分析得,該線性方程復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.993,判定系數(shù)R2為0.986,接近于1,初步表明擬合效果較好;模型殘差進(jìn)行獨立性檢驗,DW=0.653,查詢Durbin Watson table可以發(fā)現(xiàn)本例DW值恰好出在無自相關(guān)性的值域之中,認(rèn)定殘差獨立,通過檢驗;回歸方程顯著性檢驗的概率P=0.000<0.01,表明由自變量“粘度”和因變量“透明質(zhì)酸含量”建立的線性關(guān)系回歸模型具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.2 二次項曲線回歸分析 二次項曲線回歸分析模型為:

Y=0.404+0.108X-0.00025X2

經(jīng)分析得,回歸方程顯著性檢驗的F值為327.6,判定系數(shù)R2為0.995,回歸方程顯著性檢驗的概率P值為0.000,說明模型高度顯著。

2.3.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種按誤差反向傳播訓(xùn)練的多層前饋網(wǎng)絡(luò),具有很強(qiáng)的非線性映射能力,能很好地應(yīng)用于非線性預(yù)測問題[21-23]。取上述66組實驗數(shù)據(jù)構(gòu)建三層結(jié)構(gòu)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[24-26],輸入層、輸出層各一個神經(jīng)元,分別代表發(fā)酵液粘度和發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量,輸入層到隱含層的傳遞函數(shù)為logsig函數(shù),隱含層到輸出層之間選擇purline線性傳遞函數(shù)。網(wǎng)格訓(xùn)練函數(shù)采用應(yīng)用Levenberg-Marquardt優(yōu)化后的trainlm訓(xùn)練函數(shù)算法。經(jīng)多次試錯法訓(xùn)練選擇最佳隱含層神經(jīng)元個數(shù)為10個,訓(xùn)練13次后平均R值為0.9996。

2.4 三種數(shù)學(xué)模型預(yù)測效果比較

對2020030101、2020030203其他兩個批次22個實驗樣本進(jìn)行發(fā)酵液粘度及發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量檢測;依據(jù)發(fā)酵液粘度值利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)據(jù)處理方法獲得數(shù)學(xué)模型對發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量進(jìn)行估測;將實測值與模型估測值進(jìn)行對比,實驗樣本方差作為3種模型的評價指標(biāo)檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性,結(jié)果如表3所示。

表3 三種模型檢驗結(jié)果

由表3可知,利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的檢驗方差值最低為0.0189,表明利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立模型依據(jù)發(fā)酵液粘度對發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量預(yù)測準(zhǔn)確率最高,其次是二次項曲線回歸分析模型,一元線性回歸模型的準(zhǔn)確率最低。

3 結(jié)論

在透明質(zhì)酸發(fā)酵工業(yè)中,實時了解發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量,對掌握發(fā)酵過程狀況、判定發(fā)酵終止時間、提前準(zhǔn)備后續(xù)分離純化工作有很大的指導(dǎo)意義,找到一種準(zhǔn)確快速估測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的方法顯得尤為重要。通過對發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與菌體量、濁度、粘度、電導(dǎo)率、殘余糖含量變化規(guī)律的相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的濁度、電導(dǎo)率與透明質(zhì)酸含量之間幾乎不存在相關(guān)性,發(fā)酵液中菌體量、粘度、殘余還原糖與發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量變化相關(guān)性顯著,相關(guān)系數(shù)均在0.8以上。繼續(xù)偏相關(guān)分析,發(fā)酵液中菌體量與發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量存在虛假相關(guān),發(fā)酵液粘度與發(fā)酵液中殘余糖含量可作為描述發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的參數(shù)。考慮到發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量與粘度相關(guān)性最為顯著且檢測方法簡單,選擇發(fā)酵液粘度作為描述發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的唯一參數(shù)。對構(gòu)建一元線性回歸、二次項曲線回歸分析以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)據(jù)處理方法獲得的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗證分析,三種模型根據(jù)發(fā)酵液粘度預(yù)測實驗結(jié)果方差分別為 0.2481、0.0646、0.0189,其中BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測效果最為準(zhǔn)確。利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型只需將發(fā)酵液粘度代入模型即可準(zhǔn)確快速測定透明質(zhì)酸含量,從取樣到獲得結(jié)果,不超過20 min,極大縮短了檢測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸所需時間,對實時監(jiān)測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量及判定發(fā)酵終止時間有重要意義。此文利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建模型只取了六個批次66組實驗數(shù)據(jù),如能增大實驗樣本數(shù)量,重構(gòu)的數(shù)學(xué)模型對實驗結(jié)果預(yù)測會更加精確;此外發(fā)酵液中粘度、還原糖含量均與透明質(zhì)酸含量表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的相關(guān)性,發(fā)酵液粘度和還原糖含量是否存在相關(guān)性,利用粘度是否可預(yù)測發(fā)酵液中殘余還原糖含量有待進(jìn)一步研究。