解表清里復方干預急性支氣管炎的網絡藥理學機制

張軍城， 張濤， 李耀輝， 劉改霞， 唐秀林， 康艷， 劉伊莎

（1.陜西省中醫醫院，陜西西安 710000；2.陜西中醫藥大學，陜西咸陽 712046）

急性支氣管炎是一種常見的、具有自限性的呼吸道感染性疾病[1]。屬于中醫學“咳嗽”的范疇，以外感病邪誘發者居多，以寒邪最為常見[2-3]，外感寒邪入里，或從寒化、或從熱化。我院省名中醫曹利平主任醫師針對急性支氣管炎患者證型的動態演變規律認為表寒里熱證型最為常見，并擬定解表清里治則以及解表清里復方（金銀花、連翹、黃芩、浙貝母、桑白皮、款冬花、紫菀、陳皮、法半夏、茯苓、蘇葉、桔梗、炒麥芽）[4-5]。前期臨床研究納入100 例細菌性急性支氣管炎患者，治療組單用解表清里復方，對照組采用托西酸舒他西林聯合咳必清，結果表明解表清里復方治療急性支氣管炎療效較好，在一定程度上可以減少抗生素的使用[4]。為進一步明確解表清里復方的作用機制以推廣臨床應用，故進行本項研究，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 解表清里復方有效成分檢索本研究采用中藥系統藥理學數據庫，即TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分別檢索解表清里復方中單味中藥，按照口服生物利用度＞30%，類藥性＞0.18進行有效成分篩選提取藥物的有效成分及藥物有效成分相對應的靶基因。

1.2 有效成分-靶基因網絡構建將TCMSP 數據庫所獲得的靶基因輸入Uniprot 數據庫（http：//www.uniprot.org/），對藥物有效成分的基因名進行轉換，并將其與藥物有效成分相映射構建文本文件，然后將上述得到的文件分別導入Cytoscape v3.6.0 進行網絡構建。并點擊“network analysis”對構建的網絡進行拓撲分析，分析相關參數。

1.3 急性支氣管炎疾病基因獲取以“acute bronchitis”作為檢索詞同時檢索OMIM 數據庫（https：//omim.org/）、GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）和 DisGeNET 數據庫（http：//www.disgenet.org/）。檢索OMIM 數據庫時，在打開網頁之后點擊“Gene Map”，在搜索框中輸入檢索詞，即可得到該數據庫中的疾病基因；檢索GeneCards 數據庫時，在打開網頁之后在關鍵詞檢索框中輸入檢索詞，即可得到該數據庫中的疾病基因；檢索DisGeNET 數據庫時，在打開網頁后點擊“search”，選擇“diseases”并在下方檢索框中輸入檢索詞，即可得到該數據庫中的疾病基因。最后將上述數據庫中所得的基因進行匯總，刪除重復基因。

1.4 關鍵靶點預測打開OmicShare平臺（http：//www.omicshare.com），選擇云平臺后選擇維恩圖，再將藥物基因與疾病基因的文件導入，選擇提交后即可得到疾病基因與藥物基因的交集，也就是解表清里復方治療急性支氣管炎的核心靶點。

1.5 基因功能關聯網絡構建STRING 數據庫（https：//string-db.org/）是最常用的蛋白數據庫，在STRING 數據庫中選擇Multiple proteins，然后將OmicShare 得到的交集基因輸入搜索框中，Organism 選擇為“Homo sapiens”開始搜索，再次點擊“continue”，在設置中將分數選擇0.7，并隱藏散在的節點即可得到蛋白相互作用的網絡圖。

1.6 基因本體論（GO）富集分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是較為全面的生物功能注釋信息平臺。將解表清里復方靶基因與疾病基因的交集基因輸入DAVID 數據庫，數據類型選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”， 表 格 類 型 選 擇“gene list”，物種類型選擇“Homo sapiens”，背景選 擇 “Homo sapiens”， 再 選 擇 “Functional Annotation Tool”即可選擇進行GO 富集分析和KEGG 富集分析。進行GO 富集生物過程及KEGG富集信號通路的篩選限定條件為P＜0.05、FDR＜0.05 以及所研究疾病的相關性，若所得結果仍較多，則根據所富集基因數目選取前20 位，最后采用EXCEL進行圖形繪制。

2 結果

2.1 解表清里復方化合物成分通過TCMSP數據庫收集到：金銀花有效成分23種，相關靶點1 647個；連翹有效成分23種，相關靶點1 425個；黃芩有效成分36種，相關靶點1 203個；浙貝母有效成分7 種，相關靶點110 個；桑白皮有效成分32 種，相關靶點1 375個；款冬花有效成分22種，相關靶點1 088個；紫菀有效成分19種，相關靶點857個；陳皮有效成分5種，相關靶點479個；半夏有效成分13種，相關靶點1 302個；茯苓有效成分15種，相關靶點121 個；紫蘇有效成分14 種，相關靶點2 481個；桔梗有效成分7種，相關靶點260個；麥芽有效成分18 種，相關靶點646 個。刪除重復有效成分和重復靶點后共獲得有效成分131種，靶點134個。

2.2 急性支氣管炎疾病基因檢索OMIM 數據庫共得到疾病基因44 個，刪除重復基因后得到疾病基因30個；檢索GeneCards數據庫共得到疾病基因848 個；檢索DisGeNET 數據庫得到1 個疾病基因。將所獲得全部基因匯總，去掉重復基因后得到876個急性支氣管炎疾病基因。

2.3 藥物有效成分-靶基因網絡將含有有效成分與靶基因的文件導入Cytoscape，構建藥物有效成分-靶基因網絡。網絡中包含265個節點，1 525條邊，紅色表示藥物的靶基因，綠色表示藥物的有效成分，灰色線條作為邊即表示有效成分與靶基因之間的關系。詳見圖1。對網絡進行拓撲分析，其中節點度值（degree）越大的有效成分或靶基因提示它可能越重要，結果位于度值前5位的有效成分分 別 是 quercetin、 kaempferol、 luteolin、 betasitosterol、wogonin，度值前5 位的靶基因分別是NCOA2、PTGS1、AR、PRSS1、PPARG。見表1。

2.4 關鍵靶點預測結果將疾病基因與藥物靶基因匯總，整理成為文本文件。然后，采用OmicShare 平臺中的維恩圖繪制圖片，共得到HSPB1、 CD163、 PLAU、 CYCS、 CACNA2D1、CCNB1、 IRF1、 ALOX5、 GSTM1、 BIRC5、MDM2、 EGFR、 IKBKB、 NQO1、 ERBB3、ERBB2、 CHEK1、 MUC1、 BCL2、 MAPK8、ICAM1、 CAV1、 CYP1A1、 CASP8、 PPARG、CHEK2、 CRP、 HIF1A、 NOS3、 GSTP1、 RB1、SELE、 AHR、 NR3C1、 RAF1、 CASP9、 PCNA、CTNNB1、 ABCC1、 CHRM3、 CCND1、 NFKBIA、IGFBP3、ALB、PTGS1、VEGFA、MYC、TIMP1、ESR2、 MCL1、 PRKCA、 RASSF1、 CYP3A4、IL6、TP63、CYP1B1、APP、CASP3、PARP1等59個交集基因。見圖2。

2.5 基因功能關聯網絡為了更直觀地了解解表清里復方干預急性支氣管炎的作用機制，將上述所得疾病與藥物的交集靶點輸入STRING V11.0 平臺構建蛋白互作網絡，見圖3。網絡中共包含59個節點，227條邊，將網絡信息數據導入Cytoscape軟件進行拓撲分析發現VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8、IL6、CCND1、MYC 等基因的節點度值（大于18）遠高于其他靶點，表明上述靶點可能在疾病的治療中發揮關鍵作用，屬于核心靶點。

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析結果使用DAVID數據庫進行GO富集分析，對上述交集靶點所獲得的59個基因進行分析，共得到16個富集的生物過程聚類，分為90 個條目，其中具有顯著意義的8 個條目為：抗生素的反應、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性、轉錄的正調控DNA 模板化、異種代謝過程、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、傷口愈合、基底外側質膜。詳見圖4、表2。KEGG通路富集分析共獲得14 個富集的通路聚類，分為147 條通路，其中有顯著意義的通路26 條。刪除10條重復的通路，再排除癌癥相關的通路7條，最終剩余9條通路，分別為乙肝、弓形蟲病、病毒性心肌炎、細胞凋亡、TNF信號通路、慢性粒細胞性白血病、焦點粘附、甲狀腺激素信號通路、EB 病毒感染。詳見圖5、表3。為了更加清晰地展示解表清里復方治療急性支氣管炎的作用機制，對上述所得藥物有效成分、藥物靶點以及通路進行網絡構建，其中紅色代表通路，綠色代表化合物，藍色代表藥物靶點。詳見圖6。

圖1 解表清里復方有效成分-靶基因網絡Figure 1 The active ingredient-target gene network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe

表1 解表清里復方有效成分-靶基因網絡拓撲參數Table 1 Topological parameters of active ingredienttarget network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe

圖2 解表清里復方干預急性支氣管炎的關鍵靶點預測圖Figure 2 Prediction chart for key targets of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe intervention for acute bronchitis

圖3 解表清里復方干預急性支氣管炎的蛋白互作網絡Figure 3 Proteins interaction network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe intervention for acute bronchitis

3 討論

急性支氣管炎在老年人、免疫力低下人群以及天氣變化和季節交替時的發病率明顯升高[6-7]。據報道，急性支氣管炎約90%是呼吸道病毒所導致的，因此指南及專家共識推薦使用化痰藥、鎮咳藥、抗組胺藥以及對癥治療，不推薦常規使用抗生素[8-11]，除非有明確的細菌感染證據，如痰培養、血培養等。急性支氣管炎屬排除性診斷，沒有明確的診斷標準，也沒有特異性的治療藥物[12]。中醫藥長期以來被用于治療急性咳嗽性疾病以及其他呼吸道感染性疾病[13]，具有辨證論治的優勢，可多成分-多靶點-多途徑發揮抗菌和抗病毒的作用。探討有效治療該病的中藥方劑療效及機制具有重要的意義。

圖4 GO生物功能富集分析Figure 4 GO biological function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis

本研究采用中藥復方網絡藥理學方法基于現有數據庫資料分析解表清里復方治療急性支氣管炎的作用機制。通過TCMSP 數據庫收集到有效成分131種，靶點134個，收集到的有效成分及靶點中重復的成分較多，眾多的有效成分和靶點也表明解表清里復方中聯合多種藥物對于疾病的治療可能存在疊加效應。基因功能關聯網絡的拓撲分析發現 VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8、IL6、CCND1、MYC 等基因為核心靶點，可以認為解表清里復方主要作用于上述核心基因而發揮治療效應。其中，VEGFA 會受炎性因子的影響，且參與調節固有免疫[14]；CASP3、MAPK8、MYC 主要參與細胞凋亡，對機體受損傷的細胞予以清除從而維持自身穩定[15-17]；EGFR 可以調節細胞的增生，并與蛋白水解酶的分泌從而發揮保護黏膜和修復損傷的作用[18]；IL-6是最常見的炎癥因子，對于鑒別細菌感染與病毒感染具有一定的意義[19]；CCND1可以通過阻斷細胞周期進程發揮抑制細胞增殖并誘導其凋亡的作用[20]。

表2 GO富集篩選后的條目Table 2 GO enriched and filtered entries

表3 KEGG通路富集篩選后的條目Table 3 KEGG pathway enriched and filtered entries

圖6 解表清里復方有效成分-靶點-通路網絡Figure 6 The active ingredient-target-pathway network of Exterior-Releasing and Interior-Clearing Compound Recipe

解表清里復方是基于表寒里熱證而設立的，以清熱為主兼以解表。現代藥理學研究證實，方中黃芩[21]、桑白皮[22]及浙貝母[23]等具有清熱作用的中藥可以降低炎癥因子的表達水平，從而發揮對疾病的治療作用。GO富集分析提示解表清里復方可能通過抗生素的反應、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性、轉錄的正調控DNA 模板化、異種代謝過程、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、傷口愈合、基底外側質膜等生物過程等發揮作用。急性支氣管炎導致支氣管黏膜充血水腫從而刺激氣道黏膜、腺體分泌增多，繼而出現咳嗽、咳痰等癥狀，解表清里復方通過宣散表邪而止咳，清瀉里熱而化痰，臨床研究認為該復方的臨床療效與抗生素相比無顯著性差異[10]，推測上述生物過程中的抗生素反應及傷口愈合與治療作用的發揮關系可能更加密切[24-25]。KEGG 通路富集分析提示解表清里復方可能通過乙肝、弓形蟲病、病毒性心肌炎、細胞凋亡、TNF信號通路、慢性粒細胞性白血病、焦點粘附、甲狀腺激素信號通路、EB 病毒感染等通路發揮作用。目前研究認為導致急性支氣管炎的病原體很多，包括病毒、細菌、非典型病原體等，但以病毒感染最為常見，推測上述通路中細胞凋亡、TNF 信號通路以及EB 病毒感染與急性支氣管炎的病因和發病機制的關系可能更加密切。

綜上所述，解表清里復方對于急性支氣管炎的治療可能是通過多種藥物成分作用于多個疾病基因，通過多種機制發揮治療效應。但本研究僅僅只是基于數據庫提取單味藥物的有效成分及靶點，復方的作用也僅僅只是單味藥物的成分及靶點機械相加，而實際上中藥湯劑在煎煮過程中可能產生了更為有效的化合物，對此，有待在進一步的實驗中加以證實。