長鏈非編碼RNA-FENDRR在膀胱癌組織中的表達及臨床意義

王玉杰，沈沖，高深，達拉，胡海龍

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

膀胱癌（bladder cancer,BCa）是全球第十大最常見腫瘤，我國第七大男性惡性腫瘤，2018年全球預計約549 000新發病例，200 000死亡病例，歐美國家或地區膀胱癌發病率呈逐年上升趨勢，國內情況也類似，國家癌癥中心最新數據顯示我國膀胱癌年發病人數62 000人，發病率8.83/10萬[1-2]。膀胱癌有高復發率和容易進展等流行病學特征，因此需要長期監測與隨訪，但目前尚未找到理想的腫瘤抗原相關的瘤標，所以有必要進一步研究膀胱癌的發病機制，探索對膀胱癌早期診斷、治療與預后評價更敏感更有效的生物標志物[3-4]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200 個核苷酸的轉錄本[5]，在表觀遺傳[6]、轉錄[7]及轉錄后[8]多個水平調控基因表達，通過多種方式激活促癌基因亦或沉默抑癌基因，參與腫瘤的發生、進展及轉移等過程。LncRNA-FENDRR，全稱是FOXF1鄰近非編碼發育調控RNA，是一種新穎的長鏈非編碼RNA，來源于16號染色體，轉錄本長度為960 nt。近年來的研究證實lncRNA-FENDRR在肺癌[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]、肝癌[12]和膽管癌[13]等多種腫瘤中異常表達，廣泛涉及細胞增殖、侵襲、轉移、凋亡或耐藥等多方面調控。在泌尿生殖腫瘤中，目前已有研究報道lncRNA-FENDRR低表達與腎細胞癌[14]和前列腺癌[15]患者預后不良相關；在前列腺癌中通過lncRNA-FENDRR/miR-18a-5p/RUNX1軸調節細胞增殖和凋亡等生物過程[15]。綜上說明lncRNA-FENDRR可能是很有前景的新型生物標志物，或有望成為癌癥治療的新靶點。但是目前只有很少研究報道lncRNA-FENDRR在膀胱癌中的臨床及預后意義，所以本研究將對膀胱癌中lncRNA-FENDRR的表達水平及其與臨床特征及患者預后情況等相關性進行研究，為膀胱癌診斷與治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月—2019年5月在天津醫科大學第二醫院泌尿外科治療并進行手術切除的50例膀胱尿路上皮癌患者的癌組織及其癌旁正常組織標本，其中男44例，女6例；年齡49～85歲，平均 67.4歲；分期 Ta～T1 24 例，T2～T4 26 例，淋巴轉移陽性23例；腫瘤直徑0.5～5.5 cm，中位數2.65 cm；吸煙者29例。所有入組患者術前均未接受放化療等輔助治療，術中取距離腫瘤邊緣＞5 cm的膀胱正常黏膜作為癌旁正常組織為對照組，術后均經病理學檢查證實。癌及癌旁組織采集后立即浸入液氮快速降溫，儲存于-80℃冰箱中以備用。記錄入選患者的性別、年齡、分期、分級、腫瘤數目及大小等臨床病理特征。本研究經天津醫科大學第二醫院倫理委員會審核并批準，所有入組患者或其直系親屬術前均已同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 人膀胱上皮永生化細胞株SV-HUC-1購自上海酶研生物科技有限公司，膀胱癌細胞系中T24、5637和EJ由天津市泌尿外科研究所提供，253J-BV由西安交通大學第一附屬醫院泌尿外科李磊教授饋贈。RNA提取試劑Trizol購買自美國Invitrogen公司，組織總RNA提取試劑盒購買自美國Omega bio-tek公司，cDNA合成試劑盒、實時熒光定量PCR試劑購買自瑞士Roche公司。LncRNA-FENDRR以及內參GAPDH引物均通過Primer Premier 6.0引物設計軟件設計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LncRNA-FENDRR上游引物：5′-ACTGTCAAAACCAGCTCTGCC-3′，下游引物：5′-TGGCCTCTTGCCTTGGTTTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3′，下游引物：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取、文庫制備以及全轉錄組高通量測序 選取5例T2期及以上的膀胱癌及癌旁正常組織標本進行全轉錄組高通量測序（上海云序生物科技有限公司提供技術服務）。采用Trizol法提取組織標本的總RNA，NanoDrop ND-1000儀（Thermo Fisher Scientific,美國）測定RNA濃度、純度（A260/A280），后者在1.8～2.0之間合格；變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性以及有無gDNA污染。構建去rRNA鏈的特異性文庫，用BioAnalyzer 2100儀器（Agilent Technologies，美國）進行質控和定量后，用Illumina HiSeq 4000（PE150）上機測序。

1.3.2 生物信息學分析 經過測序獲得雙端reads，利用Q30進行質控，用cutadapt軟件（v1.9.3）去掉低質量reads，獲得高質量reads，將后者與人類參考基因組（UCSC HG19）對比。在gtf基因注釋文件指導下，使用cufflinks軟件（v2.2.1）獲得mRNA和lncRNA的FPKM值，計算兩組樣品間的fold change和P值。fold change＞2或＜-2，且P＜0.05被認為是lncRNA的表達有顯著差異。根據臨近關系，預測lncRNA的靶基因，進行GO和KEGG通路分析。

1.3.3 細胞培養 4種膀胱癌細胞系均在含10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱孵育；SVHUC-1細胞用F-12K培養基培養，其他條件同前；處于對數生長期的細胞用于下游實驗。

1.3.4 細胞和組織的RNA提取 qRT-PCR按照組織總RNA提純試劑盒說明書步驟操作，采用過柱法提純組織和細胞總RNA，經超微量可見分光光度計檢測，A260/A280在1.8～2.0視為純度合格。采用兩步法將總RNA逆轉錄為cDNA，條件設置為65℃10 min 預變性；25℃ 10 min，55℃ 30 min，85℃5 min，-20℃保存。qRT-PCR采用3步法，擴增參數：95℃ 5min 預熱；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，擴增45個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA表達的相對定量，每例組織或每種細胞設置3個復孔，求均值。

1.3.5 隨訪 本研究中對入選患者進行定期隨訪，至少每3個月隨訪1次，主要包括院內復查、電話或短信等方式。

1.4 統計學處理 使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0對本實驗所有數據進行分析及作圖，計量資料用x±s表示，計數資料比較使用χ2檢驗，兩組比較使用t檢驗。lncRNA-FENDRR表達水平與患者臨床病理特征的相關性采用χ2檢驗或Fisher精確概率計算法（雙側）。Kaplan-Meier法繪制不同亞組的術后生存曲線，用Log-rank檢驗比較兩組之間的生存率有無差異。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 差異lncRNA表達譜及其生物信息學分析 以P＜0.05、變化倍數＞2.0為標準，共篩選出103個差異表達lncRNA，其中上調36個，下調67個（圖1）。分別列舉上調和下調的前10個（表1）。對差異lncRNA進行GO功能分析，上調部分集中于組蛋白多種表觀遺傳修飾、細胞凋亡過程的調控等生物過程，常染色質等細胞組分和組蛋白結合等分子功能；下調部分集中于cAMP介導的信號轉導、mRNA剪接點選擇、調控G蛋白耦聯受體信號通路、Ras信號通路、p53介導的內在凋亡信號通路等多條信號通路、黏附連接等細胞組分和泛素蛋白連接酶活性、蛋白激酶結合等分子功能。對差異lncRNA進行KEGG通路分析，結果主要集中在化學性致癌作用和黏附連接等。

圖1 差異表達lncRNA的聚類分析圖Fig 1 The heatmap of differentially expressed lncRNAs

表1 膀胱癌中差異表達lncRNA的TOP10Tab 1 Top10 of differentially expressed lncRNAs in bladder cancer

2.2 lncRNA靶標篩選與驗證 從差異lncRNA表達譜中選擇了明顯上調（miR205HG）和顯著下調（FENDRR、CARMN、PART1、MEG3）的共 5 個 lncRNA作為靶標，在預實驗中，筆者在24例BCa組織驗證上述靶標的表達水平（圖2），結果發現PART1和MEG3組織驗證結果與測序結果相悖，針對剩余3個靶標進行文獻復習，發現FENDRR是一個比較新穎的長鏈非編碼RNA，在膀胱癌中鮮有研究，綜合考慮后，本研究選擇lncRNA-FENDRR作為研究對象。

圖2 靶標組織驗證結果Fig 2 The expression level of targets in BCa tissues

2.3 lncRNA-FENDRR在膀胱癌組織和細胞中表達水平 在50例膀胱癌組織中驗證lncRNAFENDRR表達水平，總體水平上lncRNA-FENDRR在膀胱癌組織中明顯下調（圖3A）；lncRNA-FENDRR在癌組織中的相對表達量為0.431±0.564，顯著低于癌旁組織 1.007±0.014，差異有統計學意義（t=7.222，P＜0.000 1）（圖 3B）。與 SV-HUC-1 相比，在 T24、EJ、5637和253J-BV等膀胱癌細胞系中lncRNAFENDRR顯著下調，其中5637相對表達量最低，差異有統計學意義（P＜0.000 1）（圖 3C）。

2.4 lncRNA-FENDRR與患者臨床特征的相關性 以膀胱癌組織中lncRNA-FENDRR相對表達量的上四分位數（P75）為截斷值，將lncRNAFENDRR表達量分為高表達組（12例）和低表達組（38例）。相關性分析發現，lncRNA-FENDRR表達水平與腫瘤浸潤深度相關（P=0.047 5），而與其他臨床特征無關（表2）。

圖3 lncRNA-FENDRR在組織和細胞系的表達水平Fig 3 The expression level of lncRNA-FENDRR in BCa tissues and cell lines

2.5 lncRNA-FENDRR與膀胱癌患者臨床預后的關系 定義入組患者因膀胱癌死亡為主要終點事件，入組患者最長隨訪時間為21.8個月，中位隨訪時間10.3個月。Kaplan-Meier生存曲線顯示，lncRNAFENDRR低表達組腫瘤特異性生存率（tumor specific survival rate，TSS）低于高表達組（HR=3.17，95%CI：1.37～7.32），亞組之間TSS差異具有統計學意義（Log-rankP=0.030 8）（圖 4）。

表2 lncRNA-FENDRR表達水平與膀胱癌患者臨床病理特征的相關性Tab 2 The relationship between expression level of lncRNA-FENDRR and clinical characteristics of patients with BCa

圖4 lncRNA-FENDRR不同表達組的腫瘤特異性生存率Fig 4 The TSS of the patients with low and high expression of lncRNA-FENDRR

3 討論

迄今為止，膀胱癌患者治療策略的制定與預后的評估是基于其臨床和病理指標，但這些方法的主要缺點是在某些情況下腫瘤呈現相似的組織學特征，但是對相同治療方案的反應也不同，患者的預后情況也不盡一致[16-17]。因此，應將常規方法和分子生物標志物相結合，可改善這些患者的臨床結局[18]。隨著癌癥基因組學的發展，揭示了lncRNA不僅可以作為腫瘤的新治療靶點，還可以作為早期診斷與復發和預測腫瘤患者預后的生物標志物。研究發現，在非肌層浸潤性膀胱癌中，HOTAIR[19]、UNMIBC[20]與腫瘤復發和患者不良預后相關；Li等[21]發現MALAT1表達上調與患者不良預后有關，表明MALAT1可能是預測膀胱癌患者預后的獨立生物標志物。

本研究前期通過測序獲得膀胱癌組織中lncR NA差異表達譜，從中選擇了顯著上調或下調的5個lncRNA作為候選靶標，經預實驗中組織驗證，最終選擇lncRNA-FENDRR作為研究對象。近年來研究發現，lncRNA-FENDRR在多種癌癥中均顯著下調。本研究在50例膀胱癌組織中驗證發現（圖3A、3B），總體水平上，lncRNA-FENDRR在BCa組織中也是顯著下調的；同時在4種膀胱癌細胞系中驗證，結果一致。研究表明，在非小細胞性肺癌[9]和胃癌[11]中lncRNA-FENDRR表達水平與浸潤深度顯著相關；而且在胃癌[11]、腎細胞癌[14]和前列腺癌[15]中也證實，lncRNA-FENDRR的低表達與患者不良預后相關。本研究以膀胱癌組織中lncRNA-FENDRR表達量的上四分位數為截斷值，將其分為低表達組和高表達組，通過χ2檢驗對患者臨床資料進行相關性分析（表2），結果發現lncRNA-FENDRR表達水平與浸潤深度顯著相關，提示lncRNA-FENDRR可能參與膀胱癌從低分期到高分期的進展過程。經過隨訪，結果發現lncRNA-FENDRR低表達組BCa患者的TSS明顯低于高表達組患者，差異具有統計學意義，提示在膀胱癌中lncRNA-FENDRR低表達預示著BCa患者的預后不良。但本研究的局限性在于納入病例不足，隨訪時間較短，這對結果有一定的影響。綜上所述，提示lncRNA-FENDRR可能參與膀胱癌進展過程，而且lncRNA-FENDRR低表達與BCa患者不良預后有關，但是否是膀胱癌預后的獨立預測因子需要更多研究證實。

lncRNA-FENDRR在膀胱癌組織和細胞系中均顯著下調；lncRNA-FENDRR表達水平與浸潤深度有關；隨訪發現lncRNA-FENDRR低表達組患者的TSS更低，即lncRNA-FENDRR低表達與患者不良預后相關，lncRNA-FENDRR可能是預測膀胱癌預后的潛在生物標志物，有待更多研究證實。