金屬螺釘與聚氨酯橡膠慢性脊髓損傷大鼠模型的分析比較

楊世昌,楊理,張亮，李文輝，楊亞林，孫偉粽，王云國(guó)，王凱

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科,天津300211）

慢性脊髓損傷（chronic spinal cord injury,CSCI）是一種持續(xù)存在的脊髓壓迫損傷，臨床表現(xiàn)為不同程度的神經(jīng)功能障礙。它是導(dǎo)致患者截癱和四肢癱的主要原因之一，隨著世界人口老齡化問(wèn)題愈發(fā)凸顯，CSCI發(fā)病人數(shù)逐年增多，給患者及其家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1-3]。由于CSCI標(biāo)本難以從臨床獲得，因此無(wú)法在臨床中展開(kāi)大樣本CSCI的病理生理學(xué)研究。鑒于此，建立能夠模擬人類(lèi)CSCI的動(dòng)物模型對(duì)于從整體水平、組織水平及細(xì)胞分子水平研究人類(lèi)CSCI的病理生理過(guò)程、損傷機(jī)制以及有效治療方法顯得尤為重要和緊迫[4-6]。本研究分別從螺釘擰入法和植入物法中選擇了研究歷史悠久的金屬螺釘壓迫和新近備受關(guān)注的聚氨酯橡膠壓迫制作CSCI大鼠模型，通過(guò)比較二者的CSCI大鼠模型的優(yōu)劣，探索適合CSCI研究的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)生物工程研究所購(gòu)入的體重250~300 g的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠108只（動(dòng)物批號(hào)：DWL1-20170626），依次編號(hào)，完全隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=36）、金屬螺釘壓迫組（n=36）和聚氨酯橡膠壓迫組（n=36）。大鼠飼養(yǎng)在飲食自由、光/暗周期為12 h/12 h、背景噪音（30~50）db、室溫 17~23℃、濕度 30%~70%條件下，并提供大鼠專(zhuān)用食料，保持清潔飲用水充足供應(yīng)。

圖1 抽屜尾翼掛鉤型壓迫裝置Fig 1 Drawer-Hook type compression device

圖2 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)為1.2mm×1.2mm×2.0mm的高分子聚氨酯化合物Fig 2 The standard used in the experiment is 1.2 mm×1.2 mm×2.0 mm high polymer polyurethane compound

圖3 高分子聚氨酯化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 3 Chemical structural formula of polymer polyurethane compound

1.2 壓迫材料 根據(jù)大鼠C5椎管長(zhǎng)、寬、直徑測(cè)量結(jié)果：金屬螺釘組采用不銹鋼材質(zhì)的抽屜尾翼掛鉤型壓迫裝置，螺絲直徑2.5 mm，螺距0.5 mm，螺紋區(qū)域長(zhǎng)20 mm（圖1）；聚氨酯橡膠壓迫組使用體積為1.2 mm×1.2 mm×2.0 mm，吸水后逐漸膨脹，于14 d可實(shí)現(xiàn)最大膨脹倍數(shù)2.5倍的高分子聚氨酯化合物（圖2、3）。

1.3 CSCI模型制作 根據(jù)國(guó)家脊髓損傷統(tǒng)計(jì)中心的數(shù)據(jù)庫(kù)，中頸段脊髓損傷（C3~C5）的患病率高于上頸段（C1~C2）和下頸段（C6~C8）脊髓損傷[7]。此外，因?yàn)榇笫驝5水平易于定位，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究通常采用C5水平脊髓損傷模型[7-11]。因此，本研究兼顧臨床意義與國(guó)內(nèi)外研究特點(diǎn)選擇C5水平進(jìn)行研究。

術(shù)前記錄3組大鼠的下肢行為學(xué)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（BBB 評(píng)分）[12]，按[0.3×（體重/100 g）+0.1]mL 抽取10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉。將麻醉滿(mǎn)意的大鼠于俯臥位保持軀干伸展固定在操作臺(tái)上。備皮消毒后，無(wú)菌孔巾覆蓋手術(shù)區(qū)，體表定位T2椎體棘突，沿大鼠脊柱正中自T2棘突向頭端做一長(zhǎng)約3 cm縱行切口，依次切開(kāi)C5~T2節(jié)段背部皮膚、皮下組織及頸背部筋膜，鈍性剝離椎旁肌肉，充分暴露C5~T2節(jié)段棘突及椎板。（1）假手術(shù)組：切除C6椎板后逐層關(guān)閉傷口，術(shù)后1周切口愈合列入假手術(shù)組。（2）金屬螺釘組：切除C6椎板后安放抽屜尾翼掛鉤型壓迫裝置，旋入鎖定螺釘使釘頭與椎板平齊，確認(rèn)無(wú)急性脊髓損傷后，逐層關(guān)閉傷口，術(shù)后按照0.25 mm半圈/7 d速度擰入至頸椎X線(xiàn)片顯示椎管侵占率達(dá)50%（約1.00 mm），結(jié)束螺釘擰入后繼續(xù)飼養(yǎng)1周切口愈合，該組模型制作完成。（3）聚氨酯橡膠組：切除C6椎板后將1.2 mm×1.2 mm×2.0 mm標(biāo)準(zhǔn)制備的聚氨酯壓塊塞入C5椎板與硬膜之間，逐層關(guān)閉傷口，術(shù)后1周切口愈合，該組模型制作完成。術(shù)后2.5 h復(fù)蘇后行BBB評(píng)分，若大鼠BBB評(píng)分較術(shù)前減少3分以上考慮急性脊髓損傷，處死并補(bǔ)齊相應(yīng)組，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件同前，所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后連續(xù)5 d腹腔內(nèi)注射3萬(wàn)單位慶大霉素預(yù)防傷口感染，記錄術(shù)后并發(fā)癥。

1.4 BBB評(píng)分 記錄造模術(shù)前及術(shù)后2.5 h、7 d、14 d、21 d、28 d各組的BBB評(píng)分，由熟練掌握BBB評(píng)分并經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的2名實(shí)驗(yàn)人員分別觀(guān)察并記錄后取平均值。

1.5 SEP信號(hào)測(cè)定 各組大鼠模型完成后的7、14、21、28 d（n=4）檢測(cè) SEP 信號(hào)，麻醉同前，連接好電極，恒流刺激器持續(xù)發(fā)出頻率為5.1 Hz、周期為0.2 ms的方波持續(xù)刺激大鼠前肢正中神經(jīng)，刺激強(qiáng)度逐漸增大至大鼠運(yùn)動(dòng)閾值的2倍時(shí)，可見(jiàn)前肢肌肉輕度抽搐，通過(guò)信號(hào)放大器（SCXI-1120，National Instruments Co.，TX，USA）將采集到的信號(hào)放大10萬(wàn)倍并應(yīng)用頻率介于2～2 000 Hz之間的帶通濾波屏蔽其他波的干擾，并記錄2～2 000 Hz之間的波形，通過(guò)數(shù)據(jù)采集卡（DAQcard-1200,National Instrument sCo.,TX,USA）收集所有SEP信號(hào)，所收集信號(hào)均為12位分辨率和5 000 Hz的采樣率，為提高信號(hào)準(zhǔn)確性，每組實(shí)驗(yàn)將500個(gè)SEP信號(hào)疊加后獲得最終結(jié)果。后期處理體感誘發(fā)電位波形，計(jì)算潛伏期延遲及P波與N波之間的波峰差值。

1.6 病理學(xué)觀(guān)察 麻醉同前，仰臥位，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，心臟快速灌注200～250 mL PBS溶液，待右心耳流出無(wú)色清亮液后，繼續(xù)200～300 mL 4%多聚甲醛灌注，直至大鼠軀體及四肢伸直僵硬，表示標(biāo)本固定完畢。灌注完畢后取C5脊髓節(jié)段，置于10%中性福爾馬林液中固定，脫水后，石蠟包埋，4 μm切片。分別行HE和TUNEL染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)中所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以x±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較行兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均由SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 假手術(shù)組耗時(shí)1周，無(wú)急性脊髓損傷例數(shù)，術(shù)后均成活；金屬螺釘組耗時(shí)4周，術(shù)后出現(xiàn)急性脊髓損傷3例，因傷口感染死亡1例，造模成功率88.89%；聚氨酯橡膠組耗時(shí)4周，術(shù)后出現(xiàn)急性脊髓損傷2例，無(wú)死亡例數(shù)，造模成功率94.44%。

2.2 BBB評(píng)分 造模術(shù)后各組大鼠BBB評(píng)分隨時(shí)間變化見(jiàn)圖4。術(shù)后假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)間金屬螺釘組與聚氨酯橡膠組較假手術(shù)組評(píng)分顯著降低（金屬螺釘組比假手術(shù)組t=9.671，P＜0.000 1；聚氨酯橡膠組比假手術(shù)組t=4.997，P=0.002 5），且金屬螺釘組評(píng)分低于聚氨酯橡膠組（t=2.705，P=0.035 3），金屬螺釘組評(píng)分隨術(shù)后時(shí)間的推移持續(xù)降低，聚氨酯橡膠組在術(shù)后21 d降到最低后開(kāi)始上升。

圖4 造模術(shù)后各組大鼠BBB評(píng)分與時(shí)間的關(guān)系Fig 4 The relationship between BBB scores and time in each group after modeling

2.3 體感誘發(fā)電位（SEP） 造模術(shù)后各組大鼠SEP檢測(cè)的潛伏期（圖5）和波幅（圖6）隨時(shí)間變化的結(jié)果表明，與假手術(shù)組各時(shí)間相比，金屬螺釘組和聚氨酯橡膠組的潛伏期明顯延長(zhǎng)（金屬螺釘組比假手術(shù)組t=18.02，P＜0.000 1；聚氨酯橡膠組比假手術(shù)組t=10.82，P＜0.000 1），波幅顯著降低（金屬螺釘組比假手術(shù)組t=145.5，P＜0.000 1；聚氨酯橡膠組比假手術(shù)組t=3.97，P=0.007 4），且金屬螺釘組潛伏期延長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)于聚氨酯橡膠組，金屬螺釘組波幅降低幅度先大于聚氨酯橡膠組，后較之略低。

圖5 造模術(shù)后各組大鼠SEP潛伏期與時(shí)間的關(guān)系Fig 5 The relationship between SEP incubation period and time of rats in each group after modeling

圖6 造模術(shù)后各組大鼠SEP波幅隨時(shí)間變化的關(guān)系Fig 6 Changes of SEP amplitude with time in rats of each group after modeling operation

2.4 HE染色 造模術(shù)后各組大鼠脊髓組織HE染色情況見(jiàn)圖7。與假手術(shù)組相比，金屬螺釘組與聚氨酯橡膠組均可觀(guān)察到脊髓灰質(zhì)水腫，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少伴空泡樣改變，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生并包繞神經(jīng)細(xì)胞，形成瘢痕。金屬螺釘組的上述病理學(xué)改變隨著術(shù)后時(shí)間遞增由脊髓的腹側(cè)向背側(cè)（壓迫側(cè)）漸進(jìn)性加重，聚氨酯橡膠組同時(shí)間點(diǎn)損傷表現(xiàn)為一致性。

圖7 造模術(shù)后各組大鼠脊髓組織HE染色（200×）Fig 7 HE staining of rat spinal cord tissue after modeling（200×）

2.5 TUNEL結(jié)果 造模術(shù)后各組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變化關(guān)系見(jiàn)圖8。金屬螺釘組與聚氨酯橡膠組較假手術(shù)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多（金屬螺釘組比假手術(shù)組t=4.722，P=0.003 2；聚氨酯橡膠組比假手術(shù)組t=8.263，P=0.000 2），且主要集中于脊髓灰質(zhì)前角。金屬螺釘組在術(shù)后第7天TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到最高，之后明顯減少，聚氨酯橡膠組在術(shù)后逐漸增加至術(shù)后21 d達(dá)到最高。

圖8 造模術(shù)后各組大鼠脊髓灰質(zhì)前角TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變化關(guān)系Fig 8 The number of TUNEL positive cells in the anterior horn of spinal cord gray matter changed with time after modeling

3 討論

CSCI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，為了更好的研究CSCI的發(fā)病機(jī)制、病理生理過(guò)程及其治療方法，模擬人類(lèi)CSCI的動(dòng)物模型必不可少[13]。最理想的動(dòng)物為靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，因其系統(tǒng)功能、組織結(jié)構(gòu)、生理特性等與人類(lèi)極為相似，但該類(lèi)動(dòng)物屬于稀有物種，價(jià)格昂貴，不但受?chē)?guó)家相關(guān)法律法規(guī)的保護(hù)，而且需要特殊飼養(yǎng)，因此不能滿(mǎn)足大量臨床研究的要求。狗、羊、牛等動(dòng)物同樣因進(jìn)化程度、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)等原因并不適用于臨床大樣本模擬研究。而大鼠因良好的臨床相關(guān)性、抗感染能力強(qiáng)、同源性好、生長(zhǎng)周期短、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小等諸多優(yōu)點(diǎn)，多用于當(dāng)前CSCI的大樣本實(shí)驗(yàn)研究。

理想的CSCI大鼠模型應(yīng)盡量復(fù)制人類(lèi)CSCI發(fā)生及進(jìn)展的完整過(guò)程，即脊髓能夠受到一定程度的外力壓迫，而且該壓迫是持續(xù)、漸進(jìn)性的。因此，構(gòu)建理想的CSCI大鼠模型應(yīng)盡量滿(mǎn)足以下條件：（1）操作簡(jiǎn)單，即所用設(shè)備要求不高，能快速大批制作，死亡率低，并發(fā)癥少，同時(shí)這種方法具有廣泛的適用性，能夠不受動(dòng)物體形、大小等因素的影響。（2）可控制性較好，即脊髓所受壓迫的程度、時(shí)間等可自由控制，且壓迫力能盡量符合線(xiàn)性改變的特點(diǎn)。（3）可移植性好，即在同一實(shí)驗(yàn)中能使用相同的方法使脊髓在不同部位受壓迫，使得在脊髓某節(jié)段造模困難的情況下，可更改壓迫部位。（4）臨床相似度高，能盡可能完整模擬人類(lèi)CSCI特性，且在盡量不破壞脊柱生理結(jié)構(gòu)的條件下造成椎管相對(duì)狹窄。

對(duì)于CSCI大鼠模型的制備，方法各異，主要有撞擊損傷模型、橫斷損傷模型、缺血損傷模型、鉗夾損傷模型等[14]。螺釘擰入法由Hukuda等于1972年首次用于犬CSCI模型制作，后因Kanhiku等發(fā)現(xiàn)該壓迫是一種初期速度偏快、后期速度偏慢的非線(xiàn)性壓迫，且會(huì)造成脊髓神經(jīng)纖維傳導(dǎo)損害而廢棄。1993年，al-Mefty等采用改良材質(zhì)的特氟隆螺釘造模犬CSCI并被Kanhiku等于新西蘭兔復(fù)制。Lee、Xu等采用自制金屬慢性壓迫裝置在大鼠造模成功。2004年，Kim等在大鼠的C5~C6椎板間放置聚氨酯橡膠塊，逐漸膨脹的橡膠塊對(duì)脊髓產(chǎn)生了進(jìn)行性的慢性壓迫，成功建立了CSCI大鼠模型，其操作簡(jiǎn)單，易于模擬脊髓慢性壓迫，但不易控制壓迫進(jìn)程。通過(guò)上述實(shí)例、文獻(xiàn)檢索以及前期充分驗(yàn)證，筆者分別從螺釘擰入法和植入物法中選擇了研究歷史悠久的金屬螺釘壓迫和新近備受關(guān)注的聚氨酯橡膠壓迫制作CSCI大鼠模型。

本研究成功復(fù)制了金屬螺釘壓迫與聚氨酯橡膠壓迫模型，并對(duì)二者進(jìn)行了行為學(xué)與病理學(xué)方面的研究和對(duì)比。金屬螺釘組和聚氨酯橡膠組大鼠的BBB評(píng)分均較假手術(shù)組明顯降低，且金屬壓迫組下肢行為運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況不佳，其BBB評(píng)分持續(xù)下降，聚氨酯橡膠組的恢復(fù)情況優(yōu)于金屬壓迫組。金屬螺釘組和聚氨酯橡膠組SEP信號(hào)與假手術(shù)組相比均出現(xiàn)潛伏期延長(zhǎng)和波幅下降，且金屬螺釘組神經(jīng)功能恢復(fù)略差。從HE染色上看，兩壓迫組均出現(xiàn)脊髓損傷的病理性表現(xiàn)，金屬螺釘組的脊髓損傷區(qū)域從腹側(cè)到背側(cè)（壓迫側(cè)）漸進(jìn)性加重，聚氨酯橡膠組脊髓整體均有壓迫，較為符合臨床實(shí)際病理特征。兩壓迫組較假手術(shù)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且聚氨酯橡膠組與金屬螺釘組相比，其凋亡細(xì)胞存在時(shí)間更長(zhǎng)，數(shù)目更多，脊髓壓迫更為穩(wěn)定持久。

綜上，金屬螺釘壓迫與聚氨酯橡膠壓迫的CSCI大鼠模型均有效地實(shí)現(xiàn)了對(duì)CSCI的模擬。金屬螺釘CSCI模型雖然制模步驟復(fù)雜，周期長(zhǎng)，但壓迫程度可調(diào)，因此適合損傷程度逐漸加重的CSCI研究。聚氨酯橡膠CSCI模型雖然壓迫程度不可控，但制模過(guò)程簡(jiǎn)便，周期短，成功率高，因而適用于壓迫程度穩(wěn)定的CSCI研究。