補骨脂“雷公炮制法”減毒的科學內(nèi)涵*

呂 彬 ，譚旺曉 ，劉 瀟，王小瑩 ，2，高秀梅

（1.組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617）

中藥補骨脂，又名破故紙、胡韭子、和蘭莧，是豆科一年生直立草本補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實[1]，其性溫，味辛、苦，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉的功效，主要用于治療腎陽不足，陽痿遺精，遺尿尿頻，腰膝冷痛，腎虛作喘，五更泄瀉；外用治療白癜風及斑禿[2]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂具有雌激素樣作用[3]，能夠增加骨密度，多用于治療骨質(zhì)疏松[4]；此外，補骨脂還有抗腫瘤、抗應激、抗血栓形成等作用[5-7]，在臨床上應用較為廣泛。補骨脂生品性燥，易傷陰助火，具有一定的毒副作用[8-9]，因此臨床上多使用其炮制品?！镀諠臼路健贰侗静菥V目》等醫(yī)學古籍中對補骨脂應用的記載也均以其酒制品和炒制品為主，生品使用較少。補骨脂炮制方法始見于《雷公炮炙論》，曰：“凡使，性本大燥，毒，用酒浸一宿，漉出，卻用東流水浸三日夜，卻蒸從巳至申出，日干用。”[10]后世醫(yī)家在雷公法的基礎上發(fā)展出鹽炙、酒浸、清炒等炮制方法[11]。其中，酒浸炒法始見于宋代《太平惠民和劑局方》；元代《瑞竹堂經(jīng)驗方》記載補骨脂炮制方法為“酒浸一宿，焙干”；明代至清代的炮制方法主要是用水浸泡后再蒸三時[12]。其余古籍如《太平圣惠方》《本草乘雅半偈》等也對補骨脂炮制方法有所記載?！独坠谥苏摗分刑岢鲅a骨脂炮制的目的是為了解燥毒[13]，后世如《太平惠民和劑局方》中記載的鹽炒法、《經(jīng)史證類備急本草》中提到的“入藥微炒用”等，也均以減燥毒為目的[12]?！吨袊幍洹分惺蛰d的補骨脂炮制方法為鹽炙法[2]，中藥炮制理論提到入鹽走腎，鹽炙法能夠增強補骨脂補腎納氣的功效[14]，在臨床應用中也主要以其鹽制品為主[11]。有學者對補骨脂不同炮制品有效成分補骨脂素進行了含量測定，發(fā)現(xiàn)雷公法炮制品中補骨脂素的含量遠高于鹽炙品，認為鹽炙法不是最佳的炮制方法[15-16]?，F(xiàn)代對于補骨脂雷公炮制方法描述為將補骨脂浸泡于黃酒中1 d，之后濾去黃酒，以清水浸泡藥材3 d，經(jīng)過濾、瀝干后，置于鍋中隔水蒸6 h后取出，曬干。研究表明[17]，經(jīng)雷公法炮制后，補骨脂毒性明顯降低，可能與其炮制前后化學成分的變化有關。在現(xiàn)代炮制的研究中，為了優(yōu)化炮制工藝，通常是先選擇藥物中某幾種主要成分作為標志性成分，再以不同方法對藥物進行炮制，并根據(jù)標志性成分的含量差異對炮制工藝進行篩選，而炮制前后標志性成分的變化在炮制原理的研究中意義重大[18]。筆者從炮制前后化學成分的變化分析雷公炮制法對補骨脂的影響，以探究雷公炮制法減毒的機制。

1 補骨脂肝損傷的相關化學成分研究

有關補骨脂的毒性記載始見于南北朝的《雷公炮炙論》，“性本大燥，毒”。《本草新編》中雖未言明補骨脂具有毒性，但指出補骨脂“其性過于燥”“不可輕用”。其余古籍文獻中皆未見明確的補骨脂毒性記載，但對其燥性均有一定的描述，提出補骨脂性“大溫而燥”，歷代醫(yī)家均認為“陰虛火旺者忌服”。近年來，隨著對補骨脂研究的深入，且臨床對于補骨脂不良反應的報道越來越多，補骨脂用藥的安全性也引起了廣泛的關注。婁鑫等[19]建立了一種新的有毒中藥分級方法，將補骨脂歸為“能導致毒性中藥”；現(xiàn)代醫(yī)藥典籍如《中藥大辭典》《中華本草》等對于補骨脂毒性也均有所記載。

現(xiàn)代藥理學研究表明，補骨脂主要毒性為肝臟毒性。據(jù)報道[20]，長期給予大劑量補骨脂生藥，對大鼠肝臟和腎臟功能均造成一定損害。補骨脂能夠造成小鼠肝細胞壞死，血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及炎癥因子表達上升，并引起肝細胞線粒體膜電位的降低[21]。補骨脂化學成分較為復雜，自1933年分離出第1個單體成分補骨脂素起[22]，至今已分離并鑒定出80余種化學成分，主要包括香豆素類、苯并呋喃苷類、黃酮類及單萜酚類化合物[23]。其中，補骨脂苷、異補骨脂苷等苷類成分主要分布于種子中，補骨脂酚和黃酮類成分存在于補骨脂果皮中，補骨脂素、異補骨脂素等脂溶性香豆素在果皮和種子中均有分布[24]。補骨脂中的主要成分（異）補骨脂素、（異）補骨脂苷均存可造成一定程度上的肝損傷，是補骨脂肝毒性的主要來源。補骨脂中主要化學成分見圖1。

圖1 補骨脂中主要化學成分結構圖Fig.1 Structure of main chemical components in Psoralea corylifolia

1.1 補骨脂肝損傷的臨床表現(xiàn) 近年來，關于補骨脂造成肝損傷的臨床報道屢見不鮮。2005年，韓國1例44歲婦女以補骨脂泡茶飲用，產(chǎn)生急性膽汁淤積性肝損害，患者有黃疸表現(xiàn)，肝穿刺顯示肝臟有明顯壞死[25]。2001年和2008年，國家藥品不良反應監(jiān)測中心兩次通報壯骨關節(jié)丸（含補骨脂素0.532 mg/g，異補骨脂素0.518 mg/g[26]）能夠造成肝損害，目前已有研究證實其造成肝損傷的成分為乳香、沒藥和補骨脂[27]。2006年報道1例22歲男性患者使用驅(qū)白巴布期片（維藥，含補骨脂素1.15 mg/片，異補骨脂素0.91 mg/片[28]）和補骨脂注射液（含補骨脂素18.66 μg/mL，異補骨脂素36.55 μg/mL[29]）后，出現(xiàn)黃疸和肝臟生化異常，停藥9周后檢測肝臟生化正常，后經(jīng)毒理學分析，引起肝損傷的藥物成分主要為補骨脂中的成分[30]。2018年報道1例49歲男性患者使用驅(qū)白巴布期片聯(lián)合補骨脂顆粒治療白癜風，用藥1個月后患者血清中ALT、AST及谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）表達明顯升高，給予保肝藥9周后檢測肝臟生化指標恢復正常，推測補骨脂為引起該患者肝損傷的主要藥物，其原因可能與兩藥聯(lián)用導致補骨脂劑量加大有關[31]。夏葉等[32]在研究中發(fā)現(xiàn)，使用加味青娥方（每1 g加味青娥方中含補骨脂生藥5 g）治療的36例患者中，出現(xiàn)1例ALT水平升高，但情況較為輕微；付舒菲等[33]使用丹知青娥方（含補骨脂素2.1 mg/g，異補骨脂素1.8 mg/g）治療更年期癥狀，出現(xiàn)多例心悸、胃部惡心、便秘、多眠等不良反應，16例參與者在治療8周后表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)氨酶水平，治療停止后肝功能檢測恢復正常。加味青娥方主要組成藥物為丹參、杜仲、補骨脂，丹知青娥方則在此基礎上加入中藥知母。其中，丹參、知母、杜仲均未見報道具有肝毒性，且多項研究證實此3味中藥對肝損傷均具有保護作用[34-36]，文獻作者推測補骨脂為兩方引起肝損傷的主要藥物。

1.2 補骨脂肝損傷成分研究 目前動物實驗研究提示，肝損傷的程度與補骨脂給藥時間、劑量呈一定的相關性[37]。張玥等[38]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠連續(xù)腹腔注射80 mg/kg的補骨脂素和異補骨脂素4周后，補骨脂素組小鼠血清中堿性磷酸酶（ALP）水平明顯降低，異補骨脂素則會引起小鼠血清中ALT和AST的水平上升，ALP水平下降。病理學檢查顯示補骨脂素組小鼠肝臟內(nèi)可見散在局灶性壞死，異補骨脂素組部分小鼠肝臟有肝細胞變性，提示補骨脂素和異補骨脂素均能造成一定程度上的肝損傷；此外，100 μmol/L的異補骨脂素可以抑制多藥耐藥相關蛋白 2（MRP2）、多藥耐藥相關蛋白 3（MRP3）的表達，從而引起HepG2細胞內(nèi)膽汁酸升高和細胞毒性[38-39]。宋蕾等[40]研究發(fā)現(xiàn)，采用100 mg/kg的異補骨脂素連續(xù)灌胃給藥ICR小鼠9 d，雌性小鼠肝功能下降，肝臟系數(shù)及血清中ALT和AST水平顯著升高，肝臟中膽汁酸鹽輸出泵（BSEP）、鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白（NTCP）和有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽2（OATP2）的mRNA水平均有所降低。連續(xù)灌胃給予大鼠異補骨脂素40 mg/kg，給藥28 d后，能夠?qū)Υ笫蟾挝⒘ｓw中的細胞色素P450酶（CYP450）產(chǎn)生影響，造成轉(zhuǎn)氨酶升高，進而引起肝臟損傷[41]。補骨脂水提物中存在大量的補骨脂苷和異補骨脂苷，連續(xù)灌胃給予小鼠80 g/kg的補骨脂水提物14 d，能夠使其肝臟BSEP和NTCP表達顯著降低，影響膽汁酸轉(zhuǎn)運體的表達[42]；連續(xù)灌胃給予大鼠2.1 g/kg的補骨脂水提物12周，能夠引起大鼠肝臟出現(xiàn)中度彌漫性脂肪變性[43]。王昭昕等[44]采用70%乙醇滲漉提取補骨脂中的有效成分，給予大鼠不同劑量的補骨脂提取物（生藥組為3 g/kg，其余各組低劑量組為3 g/kg，高劑量組為6 g/kg），連續(xù)灌胃給藥4周后發(fā)現(xiàn)，補骨脂生藥組、補骨脂下層滲漉液高劑量組（主要含有補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚）與滲漉藥渣高劑量組（主要含有補骨脂苷和異補骨脂苷）能夠造成明顯的肝損傷，其中滲漉藥渣高劑量組大鼠肝損傷最為明顯，推測（異）補骨脂苷肝毒性高于其他成分。本課題組前期研究也證實[45]，分別給予大鼠補骨脂水提物（主要含補骨脂苷、異補骨脂苷）及補骨脂水提后的干燥藥渣（主要含補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚），灌胃給藥4周后水提物藥渣組大鼠肝損傷程度明顯低于生藥組。黃酮類成分補骨脂甲素和Corylifol A能夠抑制肝臟微粒體中的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1，可能是造成膽紅素水平上升的原因[46]；但對其作用的評價僅局限于體外酶活性檢測，對機體肝臟的影響仍有待探究。周昆等[47]發(fā)現(xiàn)HepG2細胞的存活率與補骨脂酚終濃度和作用時間呈負相關，但是小鼠灌胃給予50 mg/kg補骨脂酚未產(chǎn)生明顯的肝損傷，提示補骨脂酚肝毒性較小。

上述研究表明，（異）補骨脂素、（異）補骨脂苷和補骨脂酚均能造成一定程度的肝損傷，其中補骨脂酚肝毒性最小，（異）補骨脂苷的肝毒性高于（異）補骨脂素。盡管已有多項實驗證實（異）補骨脂苷的肝毒性較強，但對于補骨脂中毒性成分的研究仍有所欠缺，需進一步完善。筆者對補骨脂中主要肝毒性成分的半數(shù)致死量（LD50）、半數(shù)有效量（ED50）及毒性劑量進行檢索，發(fā)現(xiàn)僅白茹玉等[48]報道了補骨脂素與異補骨脂素小鼠單次灌胃給藥的LD50分別為638.69 mg/kg與351.72 mg/kg；其余成分的LD50及補骨脂主要成分的ED50和毒性劑量等均未見報道。對補骨脂毒性成分的深入研究，不僅能夠為補骨脂臨床用藥提供參考，同時對補骨脂減毒的探究也具有指導意義。

補骨脂中主要的活性成分為補骨脂素和異補骨脂素。《中國藥典》規(guī)定，補骨脂安全劑量為6～10 g/d，且飲片中補骨脂素和異補骨脂素總含量不得少于0.7%。在關于（異）補骨脂素引起肝損傷的實驗中，給藥劑量均遠大于規(guī)定用量（約為生藥規(guī)定劑量的5～10倍，根據(jù)成分含量及體表面積折合計算），且多數(shù)研究給藥時間較長。（異）補骨脂素口服給藥的消除半衰期超過4 h，且給藥后24 h仍未代謝完全[49]；長時間持續(xù)給藥會引起代謝不及時，大量的（異）補骨脂素在體內(nèi)蓄積，從而引起肝臟損傷。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[45]，（異）補骨脂苷在補骨脂中含量較高，且能夠在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為（異）補骨脂素，使服用補骨脂后（異）補骨脂素的體內(nèi)暴露量明顯升高，最終過量的（異）補骨脂素導致肝損害的發(fā)生。而且，由于（異）補骨脂苷含量的不確定性，也使得（異）補骨脂素含量的控制變得毫無意義。因此，在用藥劑量不超過規(guī)定劑量的條件下，通過炮制的方法降低補骨脂中毒性成分（異）補骨脂苷的含量，同時保證活性成分（異）補骨脂素含量符合其有效劑量，對保障補骨脂用藥的安全性和有效性具有重要意義。

2 補骨脂“雷公炮制法”減毒機制

有關補骨脂的炮制理論始見于南北朝的《雷公炮炙論》，提出補骨脂炮制的目的是解其“燥毒”。在炮制過程中，由于受到炮制條件的影響，補骨脂內(nèi)在成分會發(fā)生質(zhì)或量的改變，毒性成分（異）補骨脂苷轉(zhuǎn)化為活性成分（異）補骨脂素，從而達到炮制減毒的目的。補骨脂素具有抗癌、調(diào)節(jié)免疫和雌激素樣作用，在血漿中代謝消除緩慢[50]，被認為是補骨脂中的主要活性成分，常作為指標成分用于補骨脂及其相關制品的質(zhì)量控制。有關研究表明，（異）補骨脂苷與（異）補骨脂素具有一定的生物轉(zhuǎn)化關系[51]，可能與補骨脂中存在的β-葡萄糖苷酶有關[52]。（異）補骨脂苷和（異）補骨脂素是補骨脂水煎液入血的主要活性成分[53]，（異）補骨脂苷在大鼠體內(nèi)吸收較快，并在一定時間后轉(zhuǎn)化為（異）補骨脂素[54]。王躍飛等[55]研究發(fā)現(xiàn)，（異）補骨脂苷可通過腸道微生物發(fā)生去糖基化，代謝為（異）補骨脂素。此外，（異）補骨脂苷在體外可以通過酸水解進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件為水解反應溫度100°C、鹽酸濃度3 mol/L、水解時間30 min[56]。在雷公法炮制過程中，通過酒浸可去除部分（異）補骨脂素及少量的（異）補骨脂苷，但其具體含量變化未見明確報道。王昭昕等[42]采用70%乙醇滲漉提取補骨脂中的有效成分，發(fā)現(xiàn)提取后補骨脂中（異）補骨脂素含量下降約60%，（異）補骨脂苷含量下降約19%，而酒浸后補骨脂化學成分含量的變化應低于滲漉提取。隨后，水浸、高溫加熱等條件則促進了（異）補骨脂苷的浸出和轉(zhuǎn)化。宋瀟等[57]研究發(fā)現(xiàn)，與生品組相比，補骨脂雷公炮制組中（異）補骨脂素的增加量約為（異）補骨脂苷的減少量的一半左右；而在酒浸炒法中，補骨脂素和異補骨脂素的含量增加值等同于補骨脂苷和異補骨脂苷的含量下降值，提示在雷公法炮制過程中有一部分（異）補骨脂苷在酒、水浸泡和水蒸過程中被消耗掉。此外，炮制后補骨脂中另一毒性成分補骨脂酚含量也有所降低。酒、水浸泡可以使補骨脂藥材結構趨于疏松，補骨脂酚在后續(xù)炮制過程中易于逸出；水蒸可以促進補骨脂酚受熱揮發(fā)[58]。李娜等[59]比較了補骨脂經(jīng)不同方法炮制后補骨脂酚的含量變化，發(fā)現(xiàn)與生品組相比，雷公法與水蒸法炮制品補骨脂酚含量下降約12%；酒浸炒法與藥典法炮制均能促進補骨脂酚含量上升；清炒法與生品組相比無明顯變化，證實“水蒸”能夠降低補骨脂酚的含量。楊濱等[16]的研究也證實了補骨脂經(jīng)雷公法炮制后，與生品相比補骨脂酚的含量下降約為10%左右。盡管在酒浸過程中，補骨脂中的有效成分（異）補骨脂素有所消耗，但在后續(xù)工藝中，經(jīng)（異）補骨脂苷轉(zhuǎn)化而成的（異）補骨脂素則能夠彌補這一損耗，且能保證（異）補骨脂素含量處于安全劑量范圍。郭晏華等[60]對不同批次的補骨脂炮制前后（異）補骨脂素含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)與生品組相比，雷公法炮制組中各批次（異）補骨脂素含量均略有上升，且符合藥典標準；多項研究證實經(jīng)雷公法炮制后補骨脂中（異）補骨脂素含量均略高于生品組[59，61-62]。經(jīng)雷公法炮制后，（異）補骨脂苷已于炮制過程中完成轉(zhuǎn)化，因此服用補骨脂雷公法炮制品后，進入體內(nèi)的（異）補骨脂苷含量較少，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化而成的（異）補骨脂素也會被迅速代謝，有利于對（異）補骨脂素的含量進行控制，使得體內(nèi)（異）補骨脂素的含量處于安全用藥范圍。宋迪等[63]基于《雷公炮炙論》，以HepaRG細胞3D培養(yǎng)獲得的類人肝臟模型結合高內(nèi)涵成像技術，證實了《雷公炮炙論》中記載的酒浸水漂法能夠有效降低補骨脂的肝毒性，并設計出最優(yōu)減毒工藝。通過炮制，補骨脂中燥性成分含量減少，印證了補骨脂炮制理論中炮制的目的是為了解燥毒的科學性。在補骨脂雷公法炮制過程中，先通過酒浸去除部分（異）補骨脂苷和（異）補骨脂素，再通過水浸促進部分毒性成分（異）補骨脂苷的浸出，最后通過水蒸的方法促進殘留的毒性成分（異）補骨脂苷轉(zhuǎn)化為活性成分（異）補骨脂素，同時促進補骨脂酚的受熱揮發(fā)，使得（異）補骨脂素的含量保持在有效劑量范圍內(nèi)，保障了補骨脂用藥的安全性及有效性，最終達到炮制減毒的目的，見圖2。

圖2 補骨脂雷公炮制法減毒機制Fig.2 Attenuation mechanism of Psoralea corylifolia by“Leigong processing method”

補骨脂作為溫腎助陽的傳統(tǒng)中藥，在臨床上應用廣泛。補骨脂生品毒性較強，主要表現(xiàn)為慢性肝損傷，也有研究發(fā)現(xiàn)其中的單萜酚類成分補骨脂酚能夠造成腎臟損傷。江芳等[64]發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚能促進HK-2細胞的凋亡、壞死，造成細胞膜脫落，且呈劑量和時間依賴性，判斷補骨脂酚能夠抑制腎臟細胞DNA的合成及有絲分裂，或直接破壞細胞膜，進而引起細胞凋亡，直接造成腎臟的損傷。補骨脂酚在補骨脂中含量較高，約占整體成分的4%[65]，但其在體內(nèi)溶解度較低，生物利用度較差[66]。張玉順等[67]使用補骨脂酚（相當于生藥量18.75、37.5、75 g/kg）連續(xù)灌胃昆明小鼠7、14、21和28 d后，出現(xiàn)不同程度腎臟病理性損害，且僅在小鼠中發(fā)現(xiàn)，在狗的研究中未見相同結果。此外，給予昆明小鼠連續(xù)灌胃21 d補骨脂不同炮制品水煎浸膏5 g/kg（補骨脂生藥量為臨床用量的25倍），發(fā)現(xiàn)腎小球毛細血管叢的內(nèi)皮細胞及間質(zhì)細胞核增大[9]。在腎毒性的實驗中，補骨脂酚的使用劑量均遠高于《中國藥典》規(guī)定的用藥劑量范圍（6～10 g），在常規(guī)劑量下尚未見有腎毒性報道，推測補骨脂酚的腎毒性可能與其高給藥量有關[68]，臨床上也未見補骨脂造成腎臟損傷的報道。

雷公法是傳統(tǒng)的補骨脂炮制方法，炮制后補骨脂毒性明顯降低，其炮制減毒的機制與主要毒性成分（異）補骨脂苷的含量下降有關。目前，對于補骨脂炮制減毒的研究仍存在許多問題。首先，對于補骨脂中毒性成分的研究仍需進一步完善；其次，在炮制過程中，不同炮制步驟如酒浸、水浸及水蒸等對補骨脂中成分的影響仍有待研究，明確各炮制步驟對補骨脂成分的影響，有利于為補骨脂炮制工藝的優(yōu)化提供指導。筆者闡述了補骨脂毒性及相關成分，對雷公炮制法減毒的科學內(nèi)涵進行探究，為補骨脂炮制減毒的研究提供科學依據(jù)。