NB-UVB對白癜風患者黑素細胞生物學特性的影響

袁相鳳 羅增香 劉相明 孟慧娟 李建娜 劉國艷

濰坊醫學院附屬醫院皮膚科，濰坊，261013

白癜風是一種常見的后天性色素脫失性皮膚病，其發病機制尚不清楚，目前認為可能與環境、遺傳、自身免疫、氧化應激、神經精神等因素有關。該病的主要臨床表現為皮膚和毛囊的泛發性或局限性白斑[1]。白癜風可在任何年齡階段起病，但多見于青壯年，無明顯的性別差異與種族差異。一般人群的患病率在0.1%～2.7%[2]，影響容貌美觀，易診而難治。黑素細胞是一類起源于外胚層的神經嵴的特定黑素生成細胞，發育成熟的黑素細胞對于有脊椎生物的眼睛、毛發、皮膚等部位的色素呈現至關重要，引起白癜風的直接原因是黑素細胞所生成的黑素過少或缺乏[3]。有學者認為，白癜風患者皮損處的黑素細胞并未完全消失，并且仍可檢測到酪氨酸酶活性殘留,因此激活殘留的黑素細胞并促進其增殖,提高黑素的合成水平是現今治療白癜風的重要方向[4]。研究證明，UVB照射能夠促進患者皮損區產生色素，以窄譜UVB(NB-UVB)效果最為顯著，特別適合應用于泛發型白癜風的治療。在白癜風患者接受NB-UVB治療后,通常表現為典型的以毛囊自中心向外逐漸擴展的點狀型復色方式過程，有學者據此現象認為可能是與存在于毛囊部的某種黑素細胞庫被激活有關[5]，但是具體的作用機制及相關作用條件尚不清楚。因此在本研究中，我們選取了34例白癜風患者對其皮損處黑素細胞進行體外培養并進行NB-UVB的輻射研究，旨在探討NB-UVB治療白癜風患者的具體機制，為臨床調整治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 培養基Medium254(Cascade公司，美國)；胎牛血清FBS、二甲基亞砜DMSO、四甲基偶氮唑藍MTT、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，美國)；BIOBASE-EL10C 酶標儀(歐萊博科學儀器公司，中國)；臺式NB-UVB輻射儀(Waldmann公司，德國)。

1.2 體外細胞培養 選取2015年2月至2018年4月在我院接受治療的34例白癜風患者皮損處黑素細胞進行體外培養。采用負壓吸皰法獲取患者皮損處的表皮組織。取得標本后立即置于含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的磷酸鹽緩沖液中進行處理，分別剪成2 mm×2 mm后挑出加入0.25%的胰蛋白酶在37℃恒溫箱中消化30 min以去除表皮，之后加入10%體積的FBS終止，吹打成單細胞懸液后進行5 min×1000 r/min離心，去上清，再向其中加入Medium254培養基，震蕩搖勻，接種于培養瓶中，置入5% CO2、37℃條件的孵箱中培養，換液間隔為48～72 h，培養至80%融合狀態后操作傳代，所有黑素細胞需利用HMB-45免疫組化染色進行鑒定。

1.3 NB-UVB輻射 利用6孔板將傳至4代的黑素細胞進行濃度調整，為2×105/mL，當培養到80%的融合狀態后，吸去培養液，加入磷酸鹽緩沖液，用功率為4.5 mW/cm2的臺式NB-UVB輻射儀采用分別不同的輻射劑量(0、20、40、60、80、100 mJ/cm2)對細胞進行輻照[6]。輻射后棄去磷酸鹽緩沖液，重新加入Medium254繼續培養，保證所有培養板與光源距離均為10 cm。

1.4 黑素細胞增殖活性測定 選取輻射后分別處于2d、3d、4d三個時間點的細胞置于96孔板中，每孔100 μL。提前4 h向每孔加入20 μL 濃度為5 g/L的MTT，4 h結束后吸去上清液,每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上緩慢振蕩15 min直到結晶被完全溶解,利用酶標儀測定將96孔板中每個樣品在490 nm處的光吸收值(A值)[7]。

1.5 黑素細胞黑素量測定 選取輻射后分別處于2 d、3 d、4 d三個時間點的細胞，吸去培養液后利用磷酸鹽緩沖液進行，1 min×2次。收集細胞后先作超聲處理再離心，5 min×1000 r/min，棄掉上清，沉淀利用10%乙醇和三氯乙酸進行洗滌，之后再次離心，5 min×1000 r/min。將處理完畢后的樣品轉移至96孔板中，100 μL/孔。每孔加入1N含油10%DMSO的NaOH，80℃水浴2 h后，利用酶標儀測490 nm各孔的光吸收值[8]。

1.6 自噬相關蛋白測定 選取輻射后處于1 d的細胞，常規提取蛋白并進行定量。之后進行凝膠電泳，轉膜采用硝酸纖維素膜。成功后先利用5%脫脂牛奶進行封閉，室溫×1 h。再分別加入鼠抗P62抗體、鼠抗p-AMPK、兔抗p-mTOR、兔抗LC3抗體，4℃×12 h。孵育結束后利用TBST液洗膜 3次×10 min。在每一個樣品上加入辣根過氧化物酶標記的山羊二抗IgG，室溫×1 h。TBST液洗膜 3次×10 min。最后得到的目的條帶用ImageJ軟件計算灰度值。

2 結果

2.1 處理后1 d自噬相關蛋白水平變化 在實驗劑量下，NB-UVB處理后1 d LC3 II/I、p-AMPK表達水平均明顯上調(P<0.05)，而p-mTOR、P26的表達水平均明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 處理后1d自噬相關蛋白水平變化

2.2 NB-UVB對黑素細胞增殖活性的影響 實驗劑量下，NB-UVB輻射后可明顯促進黑素細胞增殖(P<0.05)，其中輻射后3 d、4 d時受輻射黑素細胞的增殖率均明顯高于2 d，但輻射4 d與3 d相比無明顯差異(P>0.05)。≥40 mJ/cm2的劑量可明顯對黑素細胞的增殖產生抑制作用，使細胞處于負增長狀態(表2)。

表2 NB-UVB對黑素細胞增殖活性的影響

2.3 NB-UVB對黑素細胞合成黑素能力的影響 實驗劑量下，NB-UVB輻射后可明顯提高黑素細胞合成黑素的能力(P<0.05)，其中輻射3 d、4 d的黑素細胞的合成能力明顯大于2 d(P<0.05)，但前兩者之間無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 NB-UVB對黑素細胞合成黑素能力的影響

3 討論

在皮膚病光療中，紫外線的波長選擇具有重要意義。臨床中最常用的是長波紫外線(UVA)和中波紫外線(UVB)，其中UVB生物學活性最強，波長為290～320 nm。其中310 nm左右的紫外線治療效果最好，因此將濾除其他波長后所產生波長為311 nm左右的紫外線做為窄譜中波紫外線(NB-UVB)，它具有強烈的單一性，能夠輕易穿過真皮層從而避免在釋放能量的同時灼傷皮膚，因此在皮膚病的治療中得到了廣泛應用。

近年來在白癜風發病機制的相關研究中，自噬學說占有重要地位。由于自噬缺陷的黑素細胞存在不同程度的氧化還原平衡失常，從而導致其余正常黑素細胞受到破壞，最終引起黑素細胞脫失產生白癜風。既往研究報道，適宜劑量的UVB照射對人皮膚成纖維細胞以及HaCaT細胞的自噬起到促進作用。聶慧瓊等[9]的研究也報道了接受UVB輻射的表皮細胞中自噬反應的增強。P62是參與選擇性自噬過程的主要蛋白，能夠銜接自噬囊泡與泛素化蛋白，并將泛素化蛋白轉運至自噬體中講解，因此細胞的自噬強度通常與P62的表達水平成反比，P62蓄積意味著細胞存在自噬缺陷[10]。而在文獻中自噬的活化程度通常以LC3 I轉化為LC3 II的水平作為表示，LC3是自噬的標志性蛋白[11]。mTOR是調控細胞增殖和生長的中樞因子,AMPK則是一種關鍵的生理能量傳感器，mTOR/AMPK信號途徑與機體調控自噬的過程有著密切聯系[12]。王敏等[13]認為通過活化AMPK，抑制mTOR蛋白轉錄，可以調節UVB輻射所致角質形成細胞自噬水平。我們的研究顯示, 在實驗劑量下，NB-UVB處理后1d p-AMPK表達水平明顯上調，p-mTOR的表達水平明顯下降(P<0.05)，進一步研究顯示LC3 II/I顯著升高，P62蛋白水平下降(P<0.05)，與上述文獻一致。

雖然目前NB-UVB的臨床療效已明確，但是具體治療方案仍然存在一定爭議，因此本次研究還對NB-UVB的治療間隔進行了探索。Uitentuis等[7]選擇3次/周的NB-UVB輻射方案對白癜風患者進行治療，在12個月的療程后復色有效率高達92%。雷杰豪等[14]選擇2次/周的NB-UVB輻射方案對白癜風患者進行治療，在12個月的療程后復色有效率為82.5%，而相同實驗條件下3次/周的方案復色有效率為90.3%，由此提出NB-UVB 的最佳治療方案為3次/周。由于NB-UVB治療是一個較為長期的過程，長時間受輻射可能會增加患者光致癌或光老化的風險[15]，在選擇治療方案時需要綜合考慮臨床療效以及治療安全性，特別是警惕皮膚鱗癌的發生，這就要求在保證治療效果的前提下盡可能控制輻射頻率。我們的研究提示，NB-UVB對黑素細胞增殖的誘導作用呈現劑量依賴式遞減效應，對黑素細胞合成黑素能力的提高作用呈現劑量依賴式遞增效應。因此，我們初步認為NB-UVB治療白癜風的方案以間隔3～4 d(2次/周)為最佳，與每周照射3次相比，不僅可以保證治療效果，還可以提高治療的安全性、減輕患者的經濟負擔。

本次研究尚存在一定局限性，主要是觀察時間相對較短，下一步我們將進行持久的大樣本觀察，同時結合臨床隨訪研究獲得更為科學有效的證據。綜上所述，NB-UVB能夠有效調節白癜風患者黑素細胞自噬相關蛋白表達水平，活化自噬信號通路，同時對黑素細胞增殖活性存在先促進后抑制的作用，而對黑素合成量存在促進作用，這體現了 NB-UVB對黑素細胞生物學特性影響作用的復雜性，在體內可能還與更為廣泛的細胞因子等調節因素相關，尚需要進一步動物實驗進行探索，以明確其可能的治療機制。