消巖湯對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及對髓源性抑制細胞的影響*

王曉群，李小江，孔凡銘，王洪武，趙林林，潘 攀，劉筱迪，賈英杰

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；2.天津中醫藥大學，天津 301617）

肺癌是目前世界上發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。2019年美國和中國癌癥中心統計數據顯示肺癌發病率和病死率均占惡性腫瘤病死率的首位[1-2]。目前，西醫治療肺癌除了手術、放化療、靶向治療以外，免疫治療受到越來越多的重視。腫瘤能夠通過多種機制誘導免疫抑制細胞的產生，這是造成腫瘤免疫逃逸及腫瘤免疫治療失敗的主要原因。髓源性抑制細胞（MDSCs）具有強大的免疫抑制活性，能夠協助腫瘤細胞進行免疫逃逸[3]，是腫瘤免疫抑制微環境的主要成分之一，大量研究證實MDSCs可以促進腫瘤的進展和轉移[4-5]。MDSCs是阻礙抗腫瘤免疫的重要因素之一。因此，通過阻斷MDSCs來增強抗腫瘤免疫顯得尤為重要。

MDSCs來源于骨髓中的骨髓祖細胞和未成熟髓細胞（IMCs）。正常情況下，是粒細胞、樹突狀細胞（DC）和巨噬細胞（MF）的前體，能迅速地分化為成熟的粒細胞、DC和MF，并進入相應的器官、組織，發揮正常免疫功能。病理狀態下，這些髓系來源的前體細胞成熟受阻，停留在各個分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs[6]。小鼠體內所有的MDSCs均可以表達CD11b，可根據其表達的LY6G和LY6C的差異，分為PMN-MDSC（CD11b+LY6G+LY6C-）和 M-MDSC（CD11b+LY6G-LY6C+）兩種亞型。

中醫藥在提高患者免疫力、提高生活質量、延長生存期方面具有顯著的優勢，中國著名中醫腫瘤學專家賈英杰教授認為腫瘤免疫抑制微環境的本質為“本元虧虛”，因此，其經驗方消巖湯以黃芪和太子參為君藥，前期通過研究已經證實消巖湯能夠增強T細胞和自然（NK）細胞活性而提高腫瘤免疫功能[7-9]。本實驗通過荷瘤動物實驗，以免疫抑制細胞MDSCs為切入點，進一步研究消巖湯重塑腫瘤免疫微環境的機制，為臨床研究及應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株與動物 Lewis細胞由天津賽爾生物技術有限公司提供；SPF級C57BL/6小鼠30只，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供（合格證號：SCXK（京）2014-0004），近交系，雌雄各半，體質量（20±2）g，飼養于天津賽爾生物公司動物房。

1.2 藥物 注射用環磷酰胺0.2g，批號：H20110407，Baxter Oncology GmbH生產。消巖湯成分為生黃芪30 g，太子參15 g，郁金 10 g，姜黃 15 g，夏枯草 10 g，生牡蠣15 g，白花蛇舌草10 g，由天津中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供并進行質控。按傳統煎法，先煎40 min，二煎30 min，兩煎合兌。根據成人每日需要的生藥量140 g換算為小鼠每日生藥量30 g/kg體質量，旋轉蒸發儀濃縮為全方28.77 g/mL。置于冰箱4℃備用。

1.3 主要試劑及儀器 流式試劑：Anti-Mouse CD11b PE，FITC Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C，PerCP-Cy5.5 Anti-Mouse Ly-6C，APC Anti-Mouse Ly-6G均購自美國Becton-Dicknson公司；白細胞介素（IL）-6、轉化生長因子-β（TGF-β）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司。FAC sort型流式細胞儀，Becton-Dicknson，美國；酶標儀，Rayto，RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司。

2 方法

2.1 造模 Lewis細胞擴增培養，至80%密度為宜，用胰酶消化細胞成單個，計數后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）調整濃度到1×107/mL，所用液體均預熱，細胞離心2 000 r/min（離心半徑10 cm），5 min，棄培養液，取80 μL無血清培養基小心混合細胞（總體積約100 μL）；然后用1 mL注射器吸取細胞懸液，排空氣泡，將細胞接種于小鼠右前肢腋背部皮下，每3天觀察一次腫瘤的生長情況。2周后，處死小鼠，剝離生長旺盛期的瘤組織，選取1.0 mm×0.5 mm×0.3 mm左右生長良好的腫塊，按腫瘤（g）∶生理鹽水（mL）為1∶3比例勻漿，調細胞數為2×106/mL。在無菌條件下，每只小鼠右側腋窩皮下接種0.2 mL。1周后小鼠腋下可觸及明顯腫塊，說明荷瘤模型成功建立。

2.2 實驗分組及給藥 30只小鼠，6只為空白組，另外造模的24只小鼠隨機分為模型組、環磷酰胺（CTX）組、消巖湯組、聯合組，每組6只。空白組、模型組：每日灌胃0.2 mL生理鹽水；消巖湯組：每日予濃度為28.77g/mL的中藥湯劑灌胃2次，每次0.2mL；CTX組：腹腔注射CTX 0.2 mL（給藥劑量以60 mg/kg計，用生理鹽水稀釋，濃度為6 mg/mL）；聯合組：每日中藥湯劑灌胃2次，每次0.2 mL+腹腔注射CTX 0.2 mL。連續給藥7 d后，眼眶取血后處死小鼠，完整剝離皮下移植瘤，無菌摘取脾臟和胸腺。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 抑瘤率、脾指數、胸腺指數 處死小鼠剝離腫瘤組織，拍照并稱質量，計算抑瘤率。無菌摘取脾臟和胸腺，濾紙吸去表面液體，稱取質量，計算脾指數、胸腺指數。

抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤質量/模型組平均瘤質量）×100%

脾/胸腺指數（mg/g）=脾/胸腺質量（mg）/體質量（g）。

2.3.2 流式細胞儀檢測脾臟中MDSCs水平 脾臟研磨后，制成單細胞懸液，加PBS，反復兩次。加紅細胞裂解液，靜置5 min，配平后離心5 min，棄上清。再加入PBS重懸細胞兩次，將細胞數調整至107/mL，至于碎冰上待用。每個流式加入CD11b、Gr-1（Ly-6G and LY-6C）、LY6C 和 LY6G 各 2 μL，加入制備好的脾臟單細胞懸液100 μL，震蕩混勾后，冰上避光孵育30 min。加入PBS 2 mL混勻，洗1次。洗2次后，重懸于PBS 300 μL中，避光4℃保存。1 h內上流式細胞儀檢測。

2.3.3 ELISA方法檢測小鼠血清中IL-6、TGF-β水平 各組小鼠給藥7 d后眼眶取血，室溫避光靜置30～60 min，通過低溫高速離心機，3 500 r/min（離心半徑10 cm），離心20 min后取上清，-80°C低溫保存。擇期通過ELISA試劑盒（按照試劑盒說明操作），分別檢測白細胞介素（IL）-6和轉化生長因子-β（TGF-β）。

2.4 統計學分析 使用SPSS 22.0統計軟件數據包處理數據，計量資料分別以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠臟器指數及抑瘤率 如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠脾指數及胸腺指數顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，消巖湯組及聯合組脾指數及胸腺指數顯著升高（P＜0.05）；與CTX組相比，消巖湯組及聯合組脾指數顯著升高（P＜0.05），聯合組胸腺指數顯著增高（P＜0.05）；此外，收集各組小鼠腫瘤，計算抑瘤率結果表明，消巖湯、環磷酰胺及聯合用藥干預均可抑制腫瘤生長，抑瘤率分別為20.3%、49.7%及56.7%。見圖1。

表1 各組小鼠臟器指數及抑瘤率比較Tab.1 Comparison of visceral index and tumor inhibition rate of mice in each group

圖1 各組小鼠瘤體照片Fig.1 Tumors images of mice in each group

3.2 MDSCs百分比 與空白組相比，模型組小鼠脾臟中MDSCs百分比顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，消巖湯組、CTX組及聯合組小鼠脾臟中MDSCs百分比不同程度顯著降低（P＜0.05）；與CTX組相比，聯合組小鼠脾臟中MDSCs百分比顯著降低（P＜0.05），見表 2、圖 2。

表2 各組小鼠脾臟中MDSCs百分比比較（±s）Tab.2 Comparison of MDSCs percentage in spleen of mice in each group（±s）%

表2 各組小鼠脾臟中MDSCs百分比比較（±s）Tab.2 Comparison of MDSCs percentage in spleen of mice in each group（±s）%

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 MDSCs空白組 6 42.56±5.58模型組 6 77.70±7.61*消巖湯組 6 68.80±5.15#CTX 組 6 61.23±6.66#聯合用藥組 6 54.68±4.99*#

3.3 小鼠血清中IL-6、TGF-β水平 與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-6和TGF-β水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，消巖湯組、CTX 組及聯合組小鼠血清中IL-6和TGF-β水平有不同程度降低（P<0.05）；與CTX組相比，聯合組小鼠血清中TGF-β 水平顯著降低（P＜0.05），見表 3。

表3 各組小鼠血清中細胞因子水平（±s）Tab.3 Serum cytokine levels of mice in each group（±s）pg/mL

表3 各組小鼠血清中細胞因子水平（±s）Tab.3 Serum cytokine levels of mice in each group（±s）pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 CTX 組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 IL-6 TGF-β空白組 6 77.91±10.29 140.74±25.47模型組 6 155.24±11.17* 212.10±13.28*消巖湯組 6 124.88±9.68# 186.30±6.29#CTX 組 6 109.20± 9.01# 180.69±12.78#聯合用藥組 6 106.81±15.13# 148.11±23.60#△

4 討論

圖2 各組小鼠脾臟中MDSCs流式圖Fig.2 MDSCs flow diagram in spleen of mice in each group

肺癌屬于中醫“肺積”“息賁”等范疇。賈英杰教授認為在肺癌發生、發展的過程中虛、毒、瘀、濁貫穿始末，基于此，提出黜濁培本治癌法則。臨證時秉承“始終扶正培本，時時黜癌濁，以益氣為第一要務”，其認為益氣培本莫過于黃芪。《本草求真》指出：“黃芪為補氣諸藥之長，是以有耆之稱。”賈英杰教授認為非重劑不足以治重病，喜用重劑黃芪以培固本元[10]，黃芪也是其經驗方消巖湯的核心所在。消巖湯以黃芪、太子參扶正培本共為君藥，白花蛇舌草、生牡蠣、夏枯草消癌解毒共為臣藥，郁金、姜黃行氣活血為佐藥，解毒化瘀之品共同截斷癌濁生成，蜂房搜剔經絡中之癌濁為使藥。諸藥相伍，共奏扶正、解毒、祛瘀之功效。本研究結果表明，消巖湯對肺癌有一定的抑制作用，與化療藥物聯用抑瘤效果更佳。且消巖湯對小鼠脾臟和胸腺有一定的保護作用。

MDSCs是參與腫瘤免疫微環境形成的主要免疫抑制性細胞，活化和擴增后的MDSCs通過直接和間接機制抑制抗腫瘤免疫反應[11]，研究證實MDSCs通過高表達Arg-1、iNOS途徑抑制T淋巴細胞和NK細胞的抗腫瘤作用[12]，越來越多的研究證實中醫藥能降低MDSCs的免疫抑制，從而達到降低腫瘤免疫逃逸的目的。國內外通過臨床和動物實驗已經逐步證明中醫藥對MDSCs有調控作用[13]。本實驗結果表明荷瘤狀態下MDSCs可大量擴增，消巖湯可降低小鼠脾臟中MDSCs水平，與化療藥物聯用效果更顯著。

腫瘤微環境下會產生大量炎性因子，這些炎性因子能使MDSCs募集、擴增和激活，啟動免疫抑制。IL-6和TGF-β都在腫瘤免疫中起負向調節作用，IL-6能上調致癌轉錄因子STAT3[14]，進而啟動JAK/STAT3信號通路，促進MDSCs擴增。TGF-β能活化JAK1-STATl通路，激活MDSCs[15]。本實驗結果表明消巖湯能協助化療藥物下調IL-6、TGF-β的表達，抑制MDSCs擴增，重塑免疫微環境。

中醫藥治療腫瘤的主要優勢在于改善機體的內環境，尤其是重塑腫瘤相關的微環境，MDSCs是腫瘤微環境中促進腫瘤進展和轉移的關鍵成分，如今中醫藥以腫瘤微環境里的MDSCs為作用靶點也為腫瘤治療提供新思路[16-18]。目前有多種策略可以阻抑MDSCs的免疫抑制，主要包括：1）誘導髓系細胞向正性調節免疫細胞分化。2）抑制MDSCs的增殖與活化。3）增加MDSCs的消耗[19]。但是MDSCs在腫瘤免疫逃逸方面的作用機制極其復雜，在今后的研究中將更加多層次、多靶點、多通路的探討中醫藥調控MDSCs的分子機制，并將研究深入到MDSCs的具體亞型。