果樹類黃酮的提取、分離純化及檢測方法

薛曉芳 趙愛玲 任海燕

摘 要：類黃酮是果樹重要的一類次生代謝產物，是重要的生物活性物質之一，具有多種醫療保健功能，它以結合態（黃酮苷）或自由態（黃酮苷元）形式存在于果實、葉片、花等器官中。綜述了果樹類黃酮的提取技術、分離純化與含量檢測等方面的研究進展，并對果樹類黃酮未來的研究方向進行了展望。旨在為果樹類黃酮開發利用提供理論參考。

關鍵詞：果樹;類黃酮;提取;分離;檢測

文章編號：2096-8108（2020）05-0053-05 ?中圖分類號：S665.1 ?文獻標識碼：A

Abstract：Flavonoids are an important type of secondary metabolites in fruit trees， which are one of the important bioactive substances and have a variety of medical and healthcare functions. They are present in fruits， leaves， and flowers in the form of binding states or free states. In this paper， the extraction， separation， purification and content identification technology of flavonoids were reviewed. The future research direction of flavonoids in fruit trees was forecasted. The aim was to provide theoretical reference for the development and utilization of flavonoids in fruit trees.

Keywords：fruit trees; flavonoid; extraction; separation; detection

類黃酮（flavonoids），是一類結構中有2-苯基色原酮的特殊化合物[1]，泛指通過中央三碳鏈與兩個芳香環（A環和B環）相互連接而成的多元酚類化合物，即類黃酮都具有C6-C3-C6的基本結構[2-3]。類黃酮在植物中多與糖結合以苷元（結合態）的形式存在，僅有一少部分以自由態形式存在。依據其芳香環的氧化狀態不同，可將類黃酮化合物分為黃酮醇（falvonols）、查爾酮（chalcones）、黃酮（favones）、異黃酮（isoflavones）、花色素（anthocyanins）、原花色素（proanthocyanins）、黃烷酮（flavanones）、黃烷醇（flavanols或兒茶素catechins）等[4]。目前為止，已報道的類黃酮化合物多達9 000種[5]。近年來，由于類黃酮化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等醫療保健功能而受到人們的日益關注[6]。類黃酮是果樹的一類重要的次生代謝產物，本文綜述了果樹類黃酮的提取、分離純化與含量檢測方法等方面的相關研究，并對果樹類黃酮未來的研究方向進行了展望。旨在為果樹類黃酮開發利用提供理論參考。

1 類黃酮的提取方法

類黃酮的提取技術及提取效率直接影響后續的分離純化與含量檢測等研究。目前，類黃酮化合物的提取方法主要有有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、回流輔助提取法和酶解提取法等。

1.1 有機溶劑提取法

類黃酮化合物易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑中，由于甲醇、乙酸乙酯等具有一定的毒性，故多選擇乙醇作為類黃酮化合物的提取溶劑。提取不同樹種或同一樹種不同品種或不同器官類黃酮化合物的最適乙醇濃度有差異。克熱木江·吐爾遜江等（2012）[7]研究發現，提取新疆野蘋果果實類黃酮化合物的最佳乙醇體積分數為55%。梁鵬舉等[8]采用響應面法優化灰棗中黃酮提取工藝的研究表明，當乙醇體積分數為70%時，實際優化的工藝條件與理論預測擬合程度高。山楂總黃酮、柑橘黃烷酮提取的最適乙醇體積分數分別為：70%和60%[9-10]。此外，當乙醇濃度與其他輔助條件如超聲時間、提取溫度等達到最佳組合時，可提高提取得率。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取具有操作簡便、提取效率高等優點。超聲波產生的空化效應可加速細胞壁的破裂，有利于快速釋放內容物，從而縮短提取時間，提高提取效率，該方法在生物活性物質的提取方面具有廣闊的應用前景。馬莉等[11]研究了冬棗黃酮的超聲波提取方法，得到了超聲波提取冬棗黃酮的最佳工藝：料液比125，乙醇體積分數70%，提取時間30 min。Pan等[12]優化了超聲波輔助提取山楂黃酮化合物的工藝條件。李萍等[13]采用常溫振蕩法、液氮冷凍研磨法、勻漿法和超聲法等4種方法提取蘋果果實中的類黃酮，結果表明，超聲法提取時類黃酮提取率高，方法穩定。王楠等[14]比較了超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和傳統溶劑提取法3種方法提取沙棗黃酮的效果，結果表明超聲波輔助提取效果最好。筆者對棗果實、葉片、花等不同器官類黃酮提取發現，采用超聲波輔助提取會提高類黃酮得率。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法能顯著縮短提取時間，大大提高黃酮產率。王維力等[15]采用微波-雙水相法優化了荔枝皮黃酮提取工藝，發現微波輻射時間為90 s，微波功率為270 W時，荔枝皮黃酮得率為20.74%，與模型計算值20.94%的相對誤差僅為0.97%。楊潔等[16]采用微波-離子液體輔助提取棗葉黃酮，結果表明當微波功率為195 W，微波時間為12 min時，黃酮提取率最高為3.20%。施昶等[17]研究了微波提取山楂中黃酮類化合物的工藝，得出微波輻射時間為3.7 min時，山楂葉總黃酮得率最高為8.923%的結論。可看出，不同樹種或品種的最佳微波時間差異較大。

1.4 回流輔助提取法

回流提取法由于其操作簡單、安全環保、組分提取較完全，因而被廣泛應用于果樹類黃酮提取中。吳梅青等[18]比較了堿溶液沉法、回流、超聲、微波和水提等5種方法對柑橘皮總黃酮提取效果的影響，結果發現，回流提取總黃酮含量大于其他幾種方法，其中與超聲波輔助提取比較差異不明顯，而與其他3種方法差異非常明顯。王小雙等[19]研究了核桃殼總黃酮提取工藝，結果發現采用超聲加回流提取核桃殼總黃酮提取得率為9.13%。超聲輔助提和回流輔助提取結合使用，可大大提高提取效率。

1.5 酶解提取法

酶解提取法即通過在提取過程中加入酶發生酶解反應使類黃酮提取效率大大提高的一種提取技術，通常配合有機溶劑進行提取。目前常用的酶有纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶等，其中纖維素酶和果膠酶應用較多。陳建福等[20]研究了纖維素酶輔助提取柚葉總黃酮的工藝，對酶解溫度、酶解時間、酶用量和pH值對總黃酮提取率進行了考察，結果表明，各項指標分別為56 ℃、64 min、3%和pH5.5條件下柚葉總黃酮提取率38.62 mg/g與預測值38.79 mg/g的相對誤差僅為0.44%。班若男等[21]采用超聲波輔助法加纖維素酶法提取冬棗葉片總黃酮，發現纖維素酶用量對黃酮提取率的影響最為顯著。

2 類黃酮的分離純化方法

分離純化果樹類黃酮最常用的方法是大孔樹脂法，目前常用的大孔樹脂有AB-8、D101、HPD722、HPD400、D301、DM130、HPD-100、HPD-300、NAK-9等，該方法主要以黃酮純度及樹脂純化過程中的吸附和解吸條件為評價指標。利用大孔樹脂對類黃酮化合物的純化在許多果樹上已有報道[22-23]。研究結果表明，AB-8樹脂綜合性能較好，適于純化大部分果樹類黃酮化合物。另外，采用高速逆流色譜法（HSCCC）[24]、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱[25-26]也可以對類黃酮化合物進行分離純化。對分離純化的類黃酮化合物可根據其理化性質及波普數[27]或LC-MS結合核磁共振鑒定其化學結構[28]。

3 類黃酮的檢測方法

果樹類黃酮含量的檢測方法有多種，主要包括分光光度法[29-30]、（超）高效液相色譜法（（U）HPLC）[31-32]、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）[33]、薄層色譜法[34]、毛細管電泳法[35]等。前3種方法應用較多，每種檢測技術各有特點。分光光度計法方法簡單、使用方便、成本低，但只能粗略測定總類黃酮含量;而色譜法主要用于檢測單體組分，例如（U）HPLC法由于其靈敏度高、重復性好而被廣泛應用，但該方法成本較高;LC-MS法則可以對已知或未知組分進行定性或定量分析。隨著檢測技術的不斷發展，LC-MS技術已成為代謝組學分析的主流技術[36-37]。代謝組學是檢測生物體受擾動或刺激前后或隨著植物生長發育進程的大量代謝產物的動態變化，進而闡明生物體代謝相關過程，其研究對象主要是相對分子質量1 000以下的內源性小分子代謝物[38]。果樹代謝組學是對果樹細胞、組織或器官中所有小分子代謝產物進行定量或定性分析[39-40]，近年來，基于LC-MS方法的代謝組學研究已被廣泛應用于果樹類黃酮代謝分析中[41-42]，該方法借助龐大的數據庫，可檢測到的類黃酮化合物種類多，更全面。實際工作中可根據實驗目的選擇不同的檢測方法。

4 幾種常見果樹的類黃酮含量

果樹的葉片、花、果實、種子等不同部位中均含有類黃酮物質，不同發育時期果實類黃酮含量也不同。研究結果表明，葉片、花和種子中的類黃酮含量均高于果實[43-44]，類黃酮含量隨著果實發育總體呈下降趨勢[45-46]。成熟果實是大多數果樹的主要利用部位，對比了12種常見果樹成熟期果實總類黃酮含量（表1）。可看出，不同果樹的總類黃酮含量差異較大，山楂、核桃青皮、沙棘等的類黃酮含量較高，番石榴、龍眼和杏果實的類黃酮含量較低;果皮和果肉相比，蘋果、棗、葡萄、歐李四種果樹都是果皮總黃酮含量高于果肉。應加大山楂、歐李、核桃青皮、沙棘等高類黃酮果樹的開發利用力度。

5 展望

近年來，隨著生活水平的不斷提高，對果品營養價值和保健功能的關注度越來越高。類黃酮化合物是果樹重要的次生代謝產物之一，不僅賦予果品不同的氣味與顏色，更重要的是具有多方面的生物活性與醫療保健功能，成為科研工作者研究的熱點內容。目前，果樹類黃酮化合物的研究主要是提取技術、分離純化、檢測技術、保健功能等方面，果樹類黃酮代謝分子機制方面的研究報道僅涉及蘋果[57]、柑橘[58]等大宗果樹，對大多數果樹類黃酮代謝的分子機理方面的研究還不夠深入。建議今后開展以下幾方面研究：一是建立統一、標準的果樹類黃酮化合物分離純化與檢測體系，為精準鑒定評價奠定基礎。二是關注采前、采中、采后果品類黃酮化合物含量變化，為加工確定最適采收期，另外研究加工產品加工前后類黃酮含量變化，使功能性產品真正發揮其應有的功能。三是運用現代分子生物學手段，如基因組學、代謝組學、蛋白質組學或多組學相結合等方法研究果樹類黃酮化合物代謝機理及調控機制，為提高果實資源開發利用率和創制高類黃酮含量新種質提供理論參考。

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