波羅蜜葉綠素缺失突變體嫩莖轉錄組分析

鄭李婷 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 吳繁花 董俊娜 曹佩娜

摘? 要：為探究葉綠素合成缺失對波羅蜜嫩莖發育的影響，以波羅蜜葉綠素缺失突變體（chlorophyll deficient mutant， CDM）嫩莖為材料進行轉錄組分析;經de novo組裝后獲得295 869個Unigenes，使用NR、NT、Swissprot、KEGG、KOG、Pfam和GO數據庫進行序列比對，共注釋了174 291個Unigenes。過濾低豐度基因后，篩選出22 988個差異基因。與對照（CK）相比，CDM中上調基因有379個，下調基因有22 609個。GO分類結果表明，共有3712個基因獲得注釋，并將其劃分為分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）和生物學過程（biological process）三大類，共48個功能組;此外，有2080個Unigenes參與到19條KEGG通路上，其中在黃酮類生物合成途徑中有30個Unigenes。該研究通過轉錄組測序，分析葉綠素合成缺失對波羅蜜嫩莖發育的影響，為木本植物莖發育的研究提供數據基礎。

關鍵詞：波羅蜜;葉綠素缺失突變體;嫩莖;轉錄組分析

中圖分類號：S718.43? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： To explore the influence of chlorophyll synthesis deficiency on the primary stem development of Artocarpus heterophyllus， the transcriptome of the primary stem of a chlorophyll deficient mutant （CDM） of A. heterophyllus was analyzed. After assembly by de novo， 295 869 Unigenes were obtained. NR， NT， Swissprot， KEGG， KOG， Pfam and GO databases were used for sequence alignment. A total of 174 291 Unigenes were annotated. After filtering the low abundance genes， 22 988 differentially expressed genes were selected. Compared with the control check （CK）， there were 379 genes up-regulated in CDM and 22 609 genes down-regulated. GO classification results showed that 3712 genes were annotated and classified into three categories： molecular function， cellular component and biological process， with a total of 48 functional groups. In addition， 2080 Unigenes were involved in 19 KEGG pathways， 30 of which were involved in flavonoids biosynthesis pathways. Through transcriptome sequencing， this paper analyzed the effect of chlorophyll synthesis deficiency on the primary stem development of A. heterophyllus， which would provide data foundation for the study on the stem development of woody plants.

Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll deficient mutant; primary stem; transcriptome analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.002

莖上承枝葉下接根部，在植物生長過程中主要起運輸和支撐的作用。莖的生長包括初生生長和次生生長。初生生長是頂端分生組織，經細胞分裂分化形成表皮、皮層和維管柱的過程[1]。國外學者通過對毛白楊（Populus tomentosa）各節間進行轉錄組測序，發現其莖主枝伸長區含特殊的碳水化合物活性酶（carbohydrate active enzymes， CAZymes）及擴展蛋白（expansins）家族成員基因。其中CAZymes中的糖基水解酶（glycoside hydrolases， GHs）小家族基因在莖伸長區顯著性表達，部分成員可能參與初級細胞壁代謝（primary cell wall metabolish）、細胞壁疏松（cell wall loosening）和細胞伸長（cell elongation）[2]。Expansins是植物細胞擴張和疏松的關鍵調控因子[3-4]。而在毛白楊莖發現數個expansins基因在莖伸長區表達，可能參與初級細胞壁的合成和修飾[2]。三羧酸循環在毛白楊莖發育早期呈下降趨勢，可能與丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase， PHD）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase， ICDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase， SDH）蛋白豐度的降低有關[5]。

2.2? 差異基因的篩選與分析

在CK和CDM中，平均表達量分別≤0.5的基因有70 218和94 226個，0.5～1的有59 403和23 361個，1～2的有77 073和20 733個，>2的有76 495和41 680個（圖3A）。過濾平均表達量≤0.5的基因后，篩選出22 988個差異基因（圖3B）。將其分為Ⅰ（CK中特有基因）、Ⅱ（CK與CDM共有基因在CDM中下調）、Ⅲ（CK與CDM共有基因在CDM中上調）和Ⅳ（CDM中特有基因）（圖3C）4部分，每個部分轉錄因子（Transcription factors，TFs）各有41、163、7和3個，抗性基因（plant resistance genes，PRGs）各有87、193、20和3個（圖3D）。通過WGCNA分析CK與CDM間差異基因的關聯模式，結果顯示所有差異基因屬于一個共表達模塊（圖3E），且同組樣品間特征向量基因表達趨于一致（圖3F）。

2.3? 差異基因GO、KEGG功能注釋

2.3.1? GO功能注釋? 將22 988個差異基因進行GO功能注釋和分析，可確定其重要的生物學功能。結果表明，共有3712個基因獲得注釋，并劃分為48個功能組（圖4）。因功能組的不同又可進一步分為三大主類：分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）和生物學過程（biological process）。三類注釋分別占79.85%、56.17%和46.82%，表示大部分差異基因與分子功能相關。分子功能注釋的基因大部分集中在催化活性（catalytic activity），且與CK相比，CDM中120個基因上調，1787個基因下調，其中CDM特有的有16個。在生物學過程中，以細胞過程（cellular process）的基因數最多，且與CK相比，CDM中大部分差異基因下調，少數上調，其中CDM特有的有8個;在細胞組分中，膜（membrane）功能組擁有的基因數最多，且CDM相對于CK發生大量下調，少數上調，其中CDM特有的有6個。

2.3.2? KEGG功能注釋? 對差異基因進行KEGG途徑分析，根據對結果中的代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information process）、環境信息處理（environmental information processing）、細胞過程（cellular processes）以及生物系統（organismal systems）5組類目進行歸類，有助于深入了解CK與CDM間差異基因所在的通路情況（圖5）。結果表明，2 080個Unigenes被注釋到19個條目，其中10個在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4部分中均有出現。代謝類目注釋的Unigenes最多，有1152個（55.38%），且以糖代謝（carbohydrate metabolism）注釋的Unigenes最多，其中CK和CDM特有的分別有109和2個。而在遺傳信息處理中，有698個（33.56%）Unigenes得到注釋，翻譯（translation）所含的Unigenes最多，且CDM相比于CK發生大量下調，少量上調，CDM特有的有2個。環境信息處理、細胞過程及組織系統所注釋的Pathway較其他分類少，分別為2、1、1條。

2.4? GO富集分析

為進一步研究波羅蜜CDM嫩莖發育過程中基因的生物學功能，將差異基因進行GO富集分析（圖6）。與CK相比，CDM有379個基因上調，22 609個基因下調。通過Q-value值分別篩選出20條最顯著的條目。結果表明，在上調基因中，20個GO條目富集顯著程度相同，而翻譯（translation）和信號轉導（signal transduction）是富集基因數較多的GO條目。在下調基因中，單加氧酶活性（monooxygenase activity）、多細胞生物發育（multicellular organism development）和作用于成對供體上的氧化還原酶活性，并結合或還原氧分子（oxidoreductase activity， acting on paired donors， with incorporation or reduction of molecular oxygen）3個GO條目最顯著富集，而膜的組成成分（interal component of membrane）是富集基因最多的GO條目。

2.5? KEGG富集分析

通過KEGG Pathway富集分析，確定差異基因參與的最主要途徑，在差異基因中找出顯著富集的pathway（圖7）。KEGG富集分析結果顯示，脂肪酸降解（fatty acid degradation）、光合作用（photosynthesis）、苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）和色氨酸代謝（tryptophan metabolism）是上調基因和下調基因共有的富集代謝通路。在上調基因中，獲得了5個氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）途徑的Unigenes，是富集基因最多的代謝通路。而在下調基因中，油菜素甾醇生物合成（brassinosteroid biosynthesis）和苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）是最為顯著富集的代謝通路。其次，二萜類生物合成（diterpenoid biosynthesis）、角質，琥珀和蠟的生物合成（cutin， suberine and wax biosynthesis）、黃酮類生物合成（flavonoid biosynthesis）和玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）等是較為顯著富集的通路，苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）是富集基因最多的代謝通路。

3? 討論

近年來，隨著轉錄組測序技術的發展，為波羅蜜分子生物學方面研究提供極大便利。學者通過對波羅蜜花被進行RNA-seq分析，探究其糖代謝相關基因差異表達的特點[24]。本研究通過轉錄組測序，分析了葉綠素合成缺失對波羅蜜嫩莖發育的影響。

波羅蜜是一種具有較高藥用價值的熱帶水果，一直深受人們喜愛，也獲得了眾多學者青睞[25]。張福平等[26]研究了波羅蜜種子中黃酮類化合物的抗氧化性;國外學者測定了新鮮波羅蜜果實球莖中總黃酮類化合物及自由基清除活性在氣調貯藏過程中的變化[27]。黃酮類化合物能清除大量自由基，此生理生化屏障在植物防御中發揮著重要作用[28]。本研究通過KEGG富集分析，獲得了30個黃酮類生物合成途徑的Unigenes，且均下調表達。后續可進一步研究這些基因的表達及相應次級代謝產物的變化，揭示黃酮類物質在波羅蜜CDM嫩莖抗病過程中的分子調控機制。

糖代謝在一定程度上能反映植株的生長狀態[29-30]。謝柳青等[17]研究發現糖代謝對波羅蜜CDM莖次生生長有影響，且相比CK，CDM發生大量下調，少量上調。本研究通過KEGG功能注釋及GO富集分析，也發現糖代謝相關基因大部分下調，且部分下調基因在光合作用途徑較顯著富集。據結果推測，糖代謝途徑中關鍵酶的合成可能受到了抑制，而進一步影響莖的發育。后續可篩選出調節糖代謝的候選基因，鑒定與光合作用信號通路之間是否存在相互作用，以期為調控木本植物莖發育關鍵基因的研究提供參考。

蛋白質是生命活動的重要物質基礎，翻譯是執行其生物合成的重要步驟[31]。在非生物脅迫因子下，植物的生長發育受到不同的影響，還可能影響其基因的表達。大量研究發現環境脅迫能抑制正常蛋白質基因的表達，誘導逆境蛋白產生[32]。而付影等[16]研究發現突變體受環境脅迫程度較深。本研究通過KEGG分類及GO富集分析，結果發現27個和9個差異上調基因分別注釋和顯著富集在翻譯途徑，說明在波羅蜜CDM嫩莖中依然有蛋白質生成。推測在波羅蜜CDM嫩莖中產生了部分逆境蛋白，使其抵御逆境傷害。而關于波羅蜜CDM嫩莖的生長發育與逆境蛋白之間的調控關系，這是后續研究可繼續探討的問題。

參考文獻

李志軍， 段黃金， 呂春霞. 分枝列當莖的發育解剖學研究[J]. 塔里木農墾大學學報， 2000， 12（3）： 12-14， 19.

Dharmawardhana P ， Brunner A M ， Strauss S H. Genome- wide transcriptome analysis of thetransition from primary to secondary stem development in Populus trichocarpa[J]. BMC Genomics， 2010， 11（1）： 150-169.

Cosgrove D J. Growth of the plant cell wall[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2005， 6（11）： 850-861.

Sampedro J， Cosgrove D J. The expansin superfamily[J]. Genome Biology， 2005， 6（12）： 242-252.

Liu J W， Hai G H， Wang C， et al. Comparative proteomic analysis of Populus trichocarpaearly stem from primary to secondary growth[J]. Journal of Proteomics， 2015， 126： 94-108.

Lucas W J， Groover A， Lichtenberger R， et al. The plant vascular system： evolution， development and functions[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2013， 55（4）： 294-388.

Hohmann-Marriott M F， Blankenship R E. Evolution of photosynthesis[J]. Annual Review of Plant Biology， 2011， 62（3930）： 515-548.

季道藩， 許馥華. 棉花葉綠素缺失的細胞質遺傳[J]. 遺傳， 1979， 1（5）： 15-19.

劉振昌， 王莉青. 苦瓜白化苗生長發育調查分析[J]. 安徽農業科學， 2016， 44（34）： 140-141.

Lu X M， Hu X J， Zhao Y Z， et al. Map-based cloning of zb7 encoding an IPP and DMAPP synthase in the MEP pathway of maize[J]. Molecular Plant， 2012， 5（5）： 1100-1112.

Yamasato A. Tanaka R， Tanaka A， Loss of the N-terminal domain of chlorophyllide a oxygenase induces photodamage during greening of Arabidopsis seedlings[J]. BMC Plant Biology， 2008， 8（1）： 64.

劉冬梅， 丁錦平， 李成偉， 等. 棉花突變體的獲得及其應用研究進展[J]. 河南農業科學， 2009， 38（11）： 11-15.