三相分離法提取胡椒油樹脂的工藝研究

陳星星 宋麗 谷風林 吳桂蘋 陶銳

摘? 要：本文以黑胡椒粉為原料，采用三相分離法（TPP）提取胡椒油樹脂，研究了胡椒粉添加量、硫酸銨質量濃度、提取液與叔丁醇體積比、pH、溫度對胡椒油樹脂得率及胡椒堿含量的影響，并通過響應面試驗優化了胡椒油樹脂的提取工藝。結果表明：最佳提取條件為胡椒粉添加量5%、硫酸銨質量濃度10%、提取液與叔丁醇的體積比1∶0.5、pH 4、溫度20 ℃，在此條件下，黑胡椒油樹脂得率為12.90%，黑胡椒油樹脂中胡椒堿含量為30.46%，驗證試驗與模型預測值基本相符。研究結果為工業化提取胡椒油樹脂提供參考。

關鍵詞：胡椒油樹脂;三相分離法;胡椒堿;提取

中圖分類號：S573; TS205? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In this study， three phase partitioning （TPP） was employed to extract the pepper oleoresin from black pepper powder. The effects of the addition amount of pepper powder， ammonium sulphate concentration， ratio of crude extract to t-butanol， pH and temperature on the yield of pepper oleoresin and piperine content were studied. In addition， the extraction process of pepper oleoresin was optimized by a response surface test. The optimal condition obtained was as follow： the addition amount of pepper powder 5%， ammonium sulphate concentration 10%， ratio of crude extract to t-butanol 1∶0.5， pH 4 and temperature 20 ℃. Under the optimal conditions， the yield of black pepper oleoresin and piperine content was 12.90% and 30.46%， respectively. The results provide a reference for the industrial extraction of pepper oleoresin.

Keywords： pepper oleoresin; three phase partitioning; piperine; extraction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.023

胡椒（Piper nigrum L.）是一種多年生熱帶作物，完全成熟后具有典型的攀援特征，胡椒的商業和營養潛力為其贏得了“香料之王”的美譽。由于驚人的香味，胡椒在食品行業中常被用作食品添加劑，具有防腐[1]和抗氧化作用[2]。在傳統醫學中用于治療感冒、發燒和許多炎癥性疾病[3-4]。

胡椒油樹脂是采用有機溶劑提取胡椒中的風味活性物質所得的粘稠、顏色較深的膏狀物，既包含了胡椒堿、胡椒精油以及色素等物質，也包含了胡椒主要的營養成分和藥用成分，保持著胡椒特有的辛辣味，可以直接食用，能夠改善食物香味，是一種重要的食品添加劑[5]。鑒于胡椒油樹脂的諸多優點，在食品行業中，人們逐漸用胡椒油樹脂代替胡椒粉和胡椒粒等產品。胡椒堿是胡椒辣味的來源主成分，其含量的高低可以用來評價胡椒油樹脂的品質[6]。胡椒油樹脂提取物具有抗炎、抗抑郁、鎮痛、抗風濕等特性[7-9]。在與其他藥物聯合治療癌癥時，它增加了其他藥物的生物利用度和有效性[10]。鑒于這些藥用特性，有必要尋找一種既有效又高效的提取方法，以提高胡椒油樹脂產量和質量。

胡椒油樹脂的提取方法主要有溶劑浸提法[11]、微波輔助提取法[12]、超聲波輔助提取法[13]、超聲微波輔助提取法[14]和超臨界CO2提取法[15]等。有機溶劑浸提胡椒油樹脂的過程中，有機溶劑消耗大，胡椒油樹脂有效成分可能會有損失。而且有機溶劑如乙醇、甲醇等沸點低，在工業化生產中易揮發，對環境污染大，不易回收，對于小型工廠來說難以滿足安全生產的要求。微波輔助提取法和超聲輔助提取法所得胡椒油樹脂得率高，但需價格不菲的儀器購買和維護費用。超臨界CO2提取法最大優勢在于無有機溶劑殘留，但操作過程中所需器材數量巨大且價格昂貴，對于胡椒油樹脂中的非揮發性成分無法充分提取[16]。鑒于上述方法存在成本高、溶劑消耗量大、選擇性差等缺點，全球正在尋找廉價、快速、綠色的萃取方式。

三相分離（three phase partitioning ， TPP）法建立于1982年，是一種簡單、較新的生物分離技術，被用于提取各種生物大分子。在微生物、植物或動物細胞勻漿中加入硫酸銨和叔丁醇，靜置一段時間即可形成三相，由上至下依次為有機相（油脂等油溶性物質）、蛋白質層、水相（糖類等水溶性物質）[17]。一般情況下，叔丁醇與水完全混溶，但加入適當濃度的硫酸銨后，叔丁醇與水分層，且密度相差較大[17]。高濃度的硫酸銨賦予水較高的介電性，叔丁醇層實際上為疏水層，它被排除在水之外，將親脂成分提取出來，極性成分集中在水相中[18]。

目前TPP已被研究者較多地用于酶和蛋白質的分離[19-23]，但利用TPP提取油脂物質的文獻卻很少。目前研究人員利用三相分離法從芒果仁、大豆[24]、米糠中提取油[25]，從姜黃[26]、生姜[27]中提取油樹脂，以及提取可可果仁脂肪[28]。

本研究采用三相分離法提取胡椒油樹脂，并測定了胡椒堿含量，旨在得到胡椒堿含量較高的胡椒油樹脂，并對其加工工藝進行響應面優化。研究了胡椒粉添加量、硫酸銨質量濃度、提取液與叔丁醇比例、pH、溫度等工藝參數對油樹脂得率及胡椒堿含量的影響。研究結果對擴展三相分離體系在油樹脂提取方面的應用具有積極意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 黑胡椒粉（過60目篩），由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供。

叔丁醇、硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、95%乙醇，均為分析純，西隴化工股份有限公司;甲醇（色譜純），西隴化工股份有限公司;胡椒堿（標準品），北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.1.2? 儀器與設備? AL04電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司;S475-B多參數測試儀，上海梅特勒托利多儀器有限公司;MTV-100多管旋渦混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司;SY11型電熱恒溫水浴鍋，常州恒隆儀器有限公司;Avanti J-30I高速冷凍型離心機，美國Beckman Coulter公司;IKA旋轉蒸發儀，廣州儀科科技公司;Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 三相分離法提取胡椒油樹脂? 取0.5 g胡椒粉末于50 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水并充分混勻，加入一定質量硫酸銨，渦旋攪拌5 min使硫酸銨固體充分溶解之后用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調節溶液pH，然后按照與提取液體積比加入叔丁醇，渦旋攪拌5 min，在特定溫度水浴鍋中靜置1 h，6400 r/min離心20 min，形成三相。將含胡椒油樹脂的有機相轉移至已稱質量的旋轉蒸發瓶中，旋轉蒸發回收叔丁醇后得胡椒油樹脂，旋轉蒸發瓶烘干至恒重后稱質量。按照下列公式計算胡椒油樹脂得率：

得率=提取所得胡椒油樹脂質量/提取用胡椒粉質量×100%

1.2.2? 胡椒堿的含量測定[29]? 參照GB/T 17528- 2009的方法測定胡椒堿含量。具體為：量取50 mL 95%乙醇于旋轉蒸發瓶中，待油樹脂完全均勻化后，吸取1 mL溶液至100 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度線，稀釋液經0.45 μm濾膜過濾后，用HPLC測定，采用外標法定量。色譜條件為：色譜柱為C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相為甲醇水溶液（體積比為77∶23），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測器波長為343 nm，進樣量為10 μL。

1.2.3? 單因素實驗? 分別對胡椒粉添加量（2.5%、5%、10%、15%、20%）、硫酸銨質量濃度（10%、20%、30%、40%、50%）、pH（4、5、6、7、8）、提取液與叔丁醇的體積比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5）、溫度（20、30、40、50、60 ℃）進行單因素實驗，以胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量為考察指標，確定各因素的最佳選擇范圍。

1.2.4? 響應面法實驗設計? 在單因素實驗結果的基礎上，利用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面優化實驗，選擇pH、提取液與叔丁醇體積比、溫度三個因素為自變量，以胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量為響應值，設計三因素三水平響應面實驗，試驗因素水平值及編碼值見表1。

1.3? 數據分析

所有數據采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0、Design Expert 8.0.6、Origin 8.0軟件處理。

2? 結果與分析

2.1? 單因素試驗

2.1.1? 胡椒粉添加量? 由圖1可知，隨著胡椒粉添加量的增加，胡椒油樹脂得率先急劇下降后逐漸趨于穩定，胡椒堿含量先下降后升高。胡椒油樹脂得率隨著胡椒粉添加量的增加而降低，可能是因為缺乏足夠的水來完成硫酸根離子的水合作用。在三相分離過程中，水與硫酸銨一起構成水相，起到分散懸浮原料的作用。胡椒粉添加量為2.5%時，胡椒油樹脂得率達24%，以95%乙醇溶解旋轉蒸發瓶中油樹脂時，發現油樹脂不能完全溶解，推斷其中可能含有雜質;此外，考慮到放大生產時，胡椒粉添加量過低會帶來溶劑消耗多和旋蒸時間長等成本增加的風險。綜合考慮這兩個原因，選擇胡椒粉添加量為5%進行下一步實驗。

2.1.2? 硫酸銨質量濃度? 由圖2可知，隨著硫酸銨質量濃度的增加，胡椒油樹脂得率降低，胡椒堿含量升高。硫酸銨質量濃度為10%時，胡椒油樹脂得率最高。綜合考慮，選擇硫酸銨質量濃度為10%。

在三相體系形成過程中，溶液中硫酸銨解離出大量的NH4+、SO42，解離出的離子結合水分子后產生鹽析效應，使蛋白質疏水沉淀，由于蛋白質的析出與相結合的油脂析出息息相關，所以這可能是硫酸銨質量濃度影響油樹脂得率的原因[19]。但具體作用情況依原料品種而定。Gaur等[24]發現50%的硫酸銨質量濃度為提取芒果仁油脂的最佳濃度，30%的硫酸銨質量濃度為提取大豆油和米糠油的最佳濃度。Varakumar等[16]在提取生姜油樹脂時，發現添加10%的硫酸銨得到的生姜油樹脂得率最高。

2.1.3? pH? 由圖3可知，隨著pH的增加，胡椒油樹脂得率先增加后降低，在pH為5時油樹脂得率最高，油樹脂中胡椒堿含量最低。胡椒油樹脂得率和胡椒堿含量隨著pH變化而變化的原因可能是，pH影響三相體系中蛋白質層的析出，從而影響油樹脂的析出。當溶液的pH小于蛋白質的等電點時，蛋白質帶正電，此時溶液中硫酸銨電離出的硫酸根陰離子可與蛋白質正電荷結合，使蛋白質結構緊縮、沉淀析出，而蛋白質層的析出又影響溶液中胡椒油樹脂的析出，從而影響油樹脂中胡椒堿的含量[24]。

2.1.4? 提取液與叔丁醇體積比? 由圖4可得，隨著提取液與叔丁醇體積比增加，胡椒油樹脂得率先升高后下降，之后趨于穩定，胡椒堿含量先下降后升高。在體積比為1∶1時油樹脂得率最高。提取液與叔丁醇體積比從1∶0.5增加到1∶1時，油樹脂得率增加，原因可能是叔丁醇的增加有助于單位體積內油樹脂在水相和有機相間的傳質。當提取液與叔丁醇體積比大于1∶2后胡椒油樹脂得率趨于穩定可能是因為胡椒油樹脂已大部分被提出。

2.1.5? 溫度? 由圖5可知，隨著溫度的升高，胡椒油樹脂得率先升高后下降，在40 ℃時得率最高。油樹脂中胡椒堿含量呈先下降后升高的趨勢。油脂的溶出屬分子擴散過程，溫度升高，分子擴散系數增大，擴散速度提高，因而油樹脂得率增加。但溫度繼續上升，油樹脂得率下降，原因可能是過高的溫度對三相體系穩定性造成一定的破壞。

2.2? 響應面試驗

2.2.1? 試驗設計與結果? 進行三因素三水平的Box-Benhnken 中心組合試驗設計，考察pH（A）、提取液與叔丁醇體積比（B）、溫度（C）對胡椒油樹脂得率與油樹脂中胡椒堿含量的影響，試驗設計及結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，得到胡椒油樹脂得率（R1）對自變量A、B、C的三元二次回歸方程如下：

R1=16.440.52A+0.005B+0.15C0.46AB+0.81AC+1.53BC0.68A23.72B20.78C2

對回歸方程進行顯著性分析，結果如表3所示，該模型的P<0.01，說明實驗選擇的二元多項模型極顯著;失擬項P>0.05，模型失擬項不顯?著，可以用該回歸方程對胡椒油樹脂得率進行預測和分析。

其中模型的A、AC、BC、A2、B2、C2為極顯著，AB為顯著。由pH（A）、提取液與叔丁醇的體積比（B）、溫度（C）3個影響因素的F值可知，各單因素對胡椒油樹脂得率影響的大小依次為：A>B>C;交互項對胡椒油樹脂得率影響的大小依次為：BC>AC>AB。

同樣對表2中胡椒油樹脂中胡椒堿含量進行回歸擬合和方差分析，結果見表3，得到油樹脂中胡椒堿含量（R2）對自變量A、B、C的擬合方程如下：

R2=24.11+0.58A0.14B+0.36C+0.72AB+1.79AC1.36BC+0.49A2+7.96B20.36C2

該模型的P<0.01，說明實驗選擇的二元多項模型極顯著;失擬項P>0.05，模型失擬項不顯著，說明該回歸方程擬合度較好，模型試驗誤差小，可以用該回歸方程對胡椒油樹脂中胡椒堿含量進行預測和分析。

其中模型的AC、B2為極顯著，BC為顯著。

由pH（A）、提取液與叔丁醇的體積比（B）、溫度（C）3個影響因素的F值可知，各單因素對胡椒油樹脂中胡椒堿含量影響的大小依次為：A>C> B;交互項對胡椒油樹脂中胡椒堿含量影響的大小依次為：AC>BC>AB。

2.2.2? 各因素間的相互作用? 利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制因子間的響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面形狀，分析因素間的交互作用對胡椒油樹脂得率和樹脂中胡椒堿含量的影響，其響應曲面分別見圖6和圖7。

根據圖6可以看出，提取液與叔丁醇體積比和溫度對胡椒油樹脂得率的影響最大，pH和溫度對胡椒油樹脂得率的影響次之，對胡椒油樹脂得率影響最小的是pH和提取液與叔丁醇體積比。

根據圖7可以看出，pH和溫度對胡椒堿含量的影響最大，提取液與叔丁醇體積比和溫度對胡椒堿含量的影響次之，pH和提取液與叔丁醇體積比對胡椒堿含量的影響最小。

2.2.3? 驗證試驗? 經響應面分析，綜合考慮胡椒油樹脂的提取得率及胡椒堿含量，得到三相分離法提取胡椒油樹脂的最佳工藝條件為pH 4.00、提取液與叔丁醇體積比1∶0.53、提取溫度20.19 ℃，預測的油樹脂得率為13.93%，胡椒堿含量為31.83%。

為方便操作，修正后的提取條件為pH 4、提取液與叔丁醇體積比為1∶0.5、提取溫度為20 ℃，該條件下得到的胡椒油樹脂得率為12.90%，油樹脂中胡椒堿含量為30.46%。試驗結果與理論值接近，說明響應曲面分析所得的模型具有參考價值。

3? 討論與結論

近年來隨著胡椒在食品和醫藥方面的廣泛應用，囊括了胡椒幾乎所有香氣成分的胡椒油樹脂受到越來越多的關注，眾多學者對胡椒油樹脂的提取進行了研究。周雪敏等[11]采用有機溶劑（乙醇）浸提法提取胡椒油樹脂，在響應面優化的工藝條件下，黑胡椒油樹脂得率為10.86%，黑胡椒油樹脂中胡椒堿含量為38.73%。周葉燕等[12]研究了微波輔助法提取黑胡椒油樹脂，實驗結果為黑胡椒油樹脂的得率為12.69%。吳桂蘋等[30]以95%的乙醇為萃取溶劑，采用熱回流提取、索氏抽提、超聲波提取、微波提取、超聲波-微波輔助等方法來提取胡椒油樹脂，結果表明，超聲-微波輔助提取可得到得率最高（17.23%）的胡椒油樹脂，油樹脂中胡椒堿含量為42.20%。上述提取胡椒油樹脂的方法都存在乙醇用量大、易揮發等缺點，且超聲-微波輔助提取所用設備及設備維修昂貴，均限制胡椒油樹脂的工業生產。周雪敏[31]采用超臨界CO2提取胡椒油樹脂，在最優條件下得到胡椒油樹脂得率為0.818%，樹脂中胡椒堿的含量為 25.65%。該方法優勢在于無有機溶劑殘留、安全無毒，但胡椒油樹脂得率低，且操作成本高。

三相分離法提取油樹脂簡單易操作，叔丁醇可回收，揮發到空氣中的有機試劑含量小，對空氣污染小。Varakumar等[16]采用三相分離法提取生姜油樹脂，在硫酸銨質量濃度10%、生姜粉添加量5%、提取液與叔丁醇體積比為1∶0.5、pH為5的條件下，生姜油樹脂得率最高，為17.3%。Kurmudle等[26]采用三相分離法提取姜黃姜油樹脂，在硫酸銨質量濃度30%、提取液與叔丁醇體積比為1∶1的條件下姜黃油樹脂得率最高。

本研究采用三相分離法提取胡椒油樹脂，考察胡椒粉添加量、硫酸銨質量濃度、pH、提取液與叔丁醇體積比和溫度對胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量的影響。選擇胡椒粉添加量為5%，硫酸銨質量濃度為10%，在單因素實驗的基礎上，選取pH、提取液與叔丁醇體積比和溫度為自變量，以胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量為響應值，根據Box-Behnken 設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法優化提取工藝，建立了響應值和各個因素之間的數學模型。結果表明，三相分離法提取胡椒油樹脂的最佳工藝條件為胡椒粉添加量為5%、硫酸銨質量濃度為10%、pH 4、提取液與叔丁醇體積比1∶0.5、溫度20 ℃，在最優條件下，胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量分別達12.90%和30.46%。三相分離法操作簡便、耗時短、成本低，體系中的有機溶劑可以回收重復利用，有利于胡椒油樹脂工業化生產。

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