國內新發危險性橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病鑒定及其病原學研究

李博勛 劉先寶 時濤 蔡吉苗 鄭肖蘭 馮艷麗 徐春華 黃貴修

摘? 要：基于目前橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病在境外主要植膠國爆發流行的態勢，以及對天然橡膠產業經濟帶來的巨大影響。筆者前期對我國海南、云南、廣東等省橡膠主產區的13個農場和膠園進行了病害踏查，在我國海南省樂東縣志仲鎮樂東保顯農場發現了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病病樣。本研究將該疑似病樣病原菌進行分離、純化和致病力測定，并通過形態學和分子系統學分析，確定該病原菌為新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）的Neopestalotiopsis aotearoa Maharachch.， K.D. Hyde & Crous;基礎生物學特性分析表明，該病原菌菌絲生長和孢子萌發的適宜溫度為28 ℃，孢子致死溫度為50 ℃;適宜pH為6.5，最適碳源為蔗糖和D-葡萄糖，最適氮源為硝酸鉀和大豆蛋白胨;最適培養基為PDA，培養8 d后產孢。初步明確了該病的病原及其基礎生物學特性，為提前儲備防治該病的相關技術措施提供理論依據。

關鍵詞：橡膠樹;擬盤多毛孢葉斑病;病原鑒定;生物學特性

中圖分類號：S794.1;S763.7? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Based on the current outbreak and epidemic situation of a novel Neopestalotiopsis leaf fall disease of rubber trees （Hevea brasiliensis） in major rubber planting countries abroad and its great impact on natural rubber industry economy， the authors conducted a preliminary inspection on 13 farms and rubber plantations in main rubber producing areas in Hainan， Yunnan and Guangdong provinces， and found suspected disease samples in Baoxian Farm， Zhizhong Town， Ledong County， Hainan. In this study， the pathogens of the suspected disease samples were isolated， purified and the pathogenicity was determined. Through morphological and molecular phylogenetic analysis， the pathogen was identified as Neopestalotiopsis aotearoa Maharachch.， K.D. Hyde & Crous. The basic biological characteristics showed that the suitable temperature for the mycelial growth and spore germination was 28 ℃， the lethal temperature of spores was 50 ℃. The optimum pH value was 6.5， the optimum carbon sources were sucrose and D-glucose， the optimum nitrogen sources were potassium nitrate and soybean peptone， and the optimum medium was PDA， which could produce spores after eight days. The pathogen and its basic biological characteristics were preliminarily identified， which would provide theoretical basis for the reserve of related technical measures for the prevention and control of the disease in advance.

Keywords： Hevea brasiliensis; Neopestalotiopsis leaf fall disease; pathogen identification; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.016

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產于南美洲的亞馬遜河流域，主要分布在巴西、秘魯和哥倫比亞，其中，巴西是南美洲最主要的產膠國。由于受到橡膠樹南美葉疫病（South American Leaf Blight，SALB）的嚴重影響，導致全球天然橡膠產業格局發生了重大的、歷史性的轉變，由原產地南美洲向亞洲、非洲等地遷移。目前，全球的天然橡膠主要分布在東南亞、南亞和非洲地區，其中亞洲的產膠量占全球的90.8%。天然橡膠是我國重要的戰略性物質資源，也是關系到國計民生和國家安全建設的可再生綠色資源。自2011年后，隨著全球天然橡膠貿易價格的不斷下滑，引發了橡膠產業經濟下滑、膠林減毀、膠農貧困等一系列問題[1]。膠園的長期失管，使得許多新病害在一些植膠國頻繁爆發流行。2014年在我國海南主要農場的中小齡膠樹和開割樹上普遍爆發流行的由Fusarium solani引起的莖桿潰瘍病，引起膠樹爆皮流膠，中小齡苗枝條回枯[2];同年在云南西雙版納發現的由F. oxysporum引起的莖基腐病，導致膠樹莖桿基部腐爛流膠[3];2015年在云南西雙版納發現了由Alternaria alternata引起的黑斑病[4];2016年在馬來西亞、印度尼西亞、越南爆發流行的由Neofusicoccum ribis引起的橡膠樹殼梭孢葉斑病，也引起很大的關注[5]。2019年9月，國際橡膠研究與發展委員會（IRRDB）年會的橡膠生產國聯合發布，由擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis sp.）真菌引起的橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病已在馬來西亞、印度尼西亞、斯里蘭卡等多個植膠國家爆發流行，導致橡膠樹大量落葉，疫情擴散蔓延迅速，短時間內難以得到有效防控，造成了巨大的經濟損失，引起各植膠國的高度重視[6]。2019年，該病已在印度尼西亞的北蘇門答臘（North Sumatra）、南蘇門答臘（South Sumatra）、邦加（Bangka）等8個省、17個橡膠農場爆發流行，發病面積達103 254 hm2，落葉率達75%～90%，且田間無抗性品種[7]。2019年1月，在泰國南部的那拉提瓦省（Narathiwas）首次發現該病，之后迅速蔓延至邦納（Pangna）、蘇拉塔尼（SuratThani）、宋克拉（Songkhla）等8個省，截止2020年1月泰國累計發病面積達112 530 hm2，并且受西南季風影響，該病害可能會進一步蔓延至泰國東部地區以及柬埔寨[8]。短短幾年時間該病在亞洲的主要植膠國爆發流行，潛在威脅巨大。

基于目前該病害在主要植膠國爆發流行的態勢，以及對天然橡膠產業經濟帶來的嚴重影響。2020年5—7月，筆者先后對海南樂東保顯農場、白沙大嶺農場、瓊中陽江農場、儋州西聯農場、國家橡膠樹種質資源圃;廣東農墾總局下設的五一農場、南華農場、建設農場、紅峰農場、廣東農墾熱帶作物研究所、中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所;云南省熱帶作物科學研究所、河口螞蝗堡農場等13個農場和橡膠園進行橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的踏查，結果發現，在海南省樂東縣志仲鎮樂東保顯農場（18°37′30.27″N，109°19′58.47″E）2年生的橡膠實生苗上發現了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病病樣。此外，筆者在白沙大嶺農場的老膠園里也發現了疑似病樣，其他農場以及中小齡和成齡膠樹上尚未發現該病的疑似病樣。鑒于該病在全球屬于新發病害，在我國也是首次發現，目前也只是在橡膠實生苗上零星發生，尚未造成大面積危害。為此，為了更好地應對、預防和監測該病在國內的發生和危害，本研究將前期發現的疑似病樣進行分離、純化、鑒定、病原學以及多基因序列分析，對病原菌進行鑒定，并研究其基礎生物學特性，更好地了解病害的基本情況，為提前儲備防治該病的相關技術措施提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病樣? 病樣于2020年5月采自我國海南省樂東縣志仲鎮樂東保顯農場（18°37′30.27″N，109°19′58.47″E）。

1.1.2? 供試菌株和材料? 2株擬盤多毛孢菌株（表1）均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離、鑒定與保存;從NCBI數據庫中下載了19個擬盤多毛孢模式種的基因信息（表1）與國內的菌株共建系統發育樹;致病力測定選用的橡膠樹品種為PR107，由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所演豐基地保存。

1.1.3? 培養基和試劑? 用于分析病原菌生長特性所用的PDA培養基、Richards培養基、玉米培養基、胡蘿卜培養基、V8培養基、燕麥培養基等均參照《植病研究方法》配制[9]。引物（表2）均由深圳華大基因科技有限公司合成;PCR擴增反應所需的Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等購自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α大腸桿菌Escherichia coli感受態細胞購自寶生物工程（大連）有限公司。其他化學試劑、藥品等均為國產分析純。

1.1.4? 儀器與設備? Bio-Rad T100型梯度PCR儀，美國伯樂公司;UVI FireReader凝膠成像系統，英國UVItec公司;Nikon NI/E型生物智能熒光顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2? 方法

1.2.1? 病菌分離、純化及其致病性測定? 采用常規病原菌分離方法[9]對橡膠樹擬盤多毛孢疑似病樣葉片進行病原菌的分離及純化。依照柯赫氏法則[11]，選取田間健康橡膠樹葉片（品種為PR107）置于帶有吸水紙的托盤內，采用菌餅穿刺接種法[12]將分離物接種到淡綠色期的橡膠葉片上，以不含病原菌的PDA培養基作為空白對照，每個處理3個重復，然后將接種后的樣品置于28 ℃培養箱中保濕培養，每天觀察葉片的發病情況，5 d后從病、健交界處重新分離、純化病原菌，從菌落形態、培養性狀以及孢子形態特征上與最初分離得到的菌株進行對比，確認病原菌的致病性。

1.2.2? 病原鑒定? 形態學鑒定：觀察并記錄病原菌在PDA培養基上的菌落形態、菌絲顏色、產孢情況等特征。用顯微鏡觀察分生孢子的形態特征、顏色、大小、附屬絲長度等。

分子生物學鑒定：采用CTAB方法[10]提取病原菌基因組DNA，用ITS、TEF、TUB等多基因的引物序列（表2）對病原菌目的基因進行PCR擴增，擴增程序和條件參照Pornsuriya等[10]的方法，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目的條帶切膠回收，然后將目的基因連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α感受態細胞，37 ℃培養過夜，挑選陽性克隆轉化子，其中的3個克隆送至深圳華大基因科技有限公司進行序列測定。

1.2.3? 多基因序列分析、遺傳距離計算和系統發育樹構建? 將ITS、TEF、TUB等基因序列在NCBI中進行單基因序列的BLAST比對，利用CodonCode Aligner V7.0.1去除測序峰圖的低質量區域，完成峰圖校對拼接和引物序列切除，然后將ITS、TEF、TUB的部分序列進行拼接，應用PAUP 4.0軟件計算種內遺傳距離;利用MEGA 10軟件最大似然法中的Tamura-Nei model構建系統發育樹。

1.2.4? 病原菌基礎生物學特性測定? 在PDA培養基上培養8 d的菌落中，加入5 mL滅菌水洗下孢子，制成濃度為1.0106個/mL的孢子懸浮液，再滴到干凈的載玻片上，同時用無菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為4.5 mm菌齡相同的菌餅接種到PDA培養基平板上，然后分別將載玻片和接菌的PDA平板置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒溫培養箱中培養，8 h后統計孢子的萌發率，7 d后觀察不同溫度下菌絲的生長情況。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節PDA培養基的pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，高溫高壓滅菌后制成平板備用，每個pH 3個重復;用等當量的C源：蔗糖、葡萄糖、D-木糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖，氮源：KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）2C2O4、牛肉浸膏、大豆蛋白胨依次替換Richards培養基中的蔗糖和KNO3，以不加任何C源（蔗糖）和N源（NaNO3）的Richards培養基作為對照，高溫高壓滅菌滅菌后，制成平板備用，每個碳、氮源3個重復;分別配制燕麥、玉米、胡蘿卜、麥芽、PDA、PSA、LB、V8、Richards培養基，每種培養基重復3次。然后將病原菌依次接種到不同pH，不同碳、氮源的培養基平板中央并置于28 ℃恒溫箱培養。7 d后觀察不同條件下病原菌的生長情況。

1.3? 數據處理

采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算菌絲的生長速率，采用SAS 9.0軟件對數據進行統計分析。

2? 結果與分析

2.1? 田間癥狀及病原菌的分離

2020年5月，筆者在海南省樂東縣保顯農場的2年生橡膠實生苗的老葉上發現了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的癥狀，葉片受害部位最初褪綠呈黃色水漬狀，隨后形成黑褐色、近圓形的病斑（圖1A），病斑進一步擴大形成中央灰白色，外圍有黑褐色壞死線和黃色暈圈的病斑，受害葉片從葉柄處脫落，僅剩下葉柄掛在樹上（圖1B、圖1C）;濕度大時，在病斑中央散生許多小黑點。另外，時濤等[13]在泰國甲米府調查過程中發現，該病除葉片外還能為害嫩梢、嫩枝、綠色膠果、種子等。但在國內尚未發現該病為害嫩枝和膠果。將病樣采回實驗室，從病健交界處分離病原菌，將病原菌進行單孢純化后保存，菌株編號為HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002。

按照柯赫氏法則[11]將分離獲得的HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株進行致病性測定，結果表明：分離得到的2株病原菌，經致病力測定后的發病癥狀與田間自然發病的癥狀相同，然后在發病部位將病原菌進行分離，所得病原菌從菌落形態、培養性狀以及孢子的形態特征都與在田間自然發病分離得到的病原菌的形態特征相同，說明分離得到的2株病原菌為疑似病樣的致病菌（圖2）。

2.2? 病原鑒定

2.2.1? 形態學鑒定? HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株在培養性狀上略有差異，但孢子形態特征相同。HNPeHNLD2001菌株在PDA培養基上的菌落邊緣成波浪狀，一層一層向外生長;菌絲白色濃密，菌落背面略微黃色（圖3）。HNPeHNLD2002菌株在PDA培養基上的菌落圓形、邊緣整齊無波浪狀;菌絲白色濃密，菌落背面略微黃色（圖4）。2個菌株在PDA上培養8 d后開始產孢，15～20 d后在菌絲上散生著許多黑色的分生孢子群落（圖5）。顯微鏡觀察發現：病原菌的分生孢子長梭形，有的稍微彎曲，每個分生孢子是4隔5細胞;分生孢子大小為18.35～ 27.12 ?m×（4.11～7.03）?m（隨機測量100個以上的分生孢子），中間3個細胞均為褐色，成熟的有色胞第三色胞顏色略淺，淺褐色，第二色胞顏色最深，深褐色，第三色胞次之;有色胞長12.53～18.97（15.26）?m。頂胞和尾胞均為三角形，無色透明;頂胞上著生無色附屬絲，2～3根，長14.7～25.3（19.94）?m;尾胞上著生一根基部附屬絲，中生，長3.13～7.13（5.48）?m（圖6）;芽管是從第三個有色胞側面萌發。參照Maharach-chikumbura等[14]的研究結果，從培養性狀和孢子形態特征上與Neopestalotiopsis aotearoa的描述最為接近（表3）。

2.2.2? 多基因序列分析及病原菌種群鑒定? 用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R和T1/Bt2b 3種引物對HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株進行ITS區、EF-1α和TUB序列擴增，分別得到大小約為513、264、808 bp的條帶。菌株序列在NCBI經BLAST比對分析，均為新擬盤多毛孢屬真菌（Neopestalotiopsis sp.），并將各單基因的序列提交至GeneBank（表1）。通過序列間的比對發現，在ITS1區的第35位點存在單核苷酸多態性（A/G），在466位點處有一個T的缺失;在TUB序列的第137位點存在單核苷酸多態性（T/C），其他序列完全一致。

采用3種多基因的部分序列進行拼接，將HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株與NCBI下載的擬盤多毛孢模式種共同構建系統發育樹（圖7），發現3個基因的加和序列能較好地反映新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis sp.）種間和種內的遺傳關系，有較高的種間、種內的區分度和分辨率，多數的進化分枝都有較高自舉支持率，不同模式種的菌株間也存在豐富的遺傳多樣性。根據多基因序列聚類分析，利用最大似然法，在相似系數為0.97時可將國內的HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002兩個菌株與N. aotearoa（CBS 367.54）劃分在同一分支上，遺傳距離最近，支持率為70%。這與泰國Pornsuriya等[10]報道的2種橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病菌N. formicarum和N. cubana存在一定差異，親緣關系較遠。為此，結合形態學鑒定和多基因序列分析結果，將國內為害橡膠樹的擬盤多毛孢葉斑病病原鑒定為半知菌類、腔孢綱、黑盤孢目、新擬盤多毛孢屬（Neope-stalotiopsis）的N. aotearoa Maharachch.， K.D. Hyde & Crous。

2.3? 病原菌生物學特性分析

生物學特性測定結果發現，HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株菌絲生長的最適溫度為28 ℃，低于15 ℃和高于35 ℃將會抑制病原菌的生長（圖8A）;分生孢子適宜溫度范圍在28～30 ℃之間，最適溫度是28 ℃，低于10 ℃或高于40 ℃都會影響孢子的萌發（圖8B）;50 ℃為孢子的致死溫度。菌絲生長適宜的pH為6.5（圖8C）。2個菌株在含D-乳糖培養基中的菌絲生長最快，但菌絲十分稀薄，長勢不好;在含有蔗糖和D-葡萄糖的培養基中菌絲濃密、生長旺盛，說明蔗糖和D-葡萄糖是該菌生長的最適C源（圖8D）。另外，2個菌株以硝酸鹽為N源的利用率明顯優于銨鹽，在含KNO3和大豆蛋白胨的培養基上生長速度最快，菌絲最濃密，是該菌生長的最適N源（圖8E）。在供試的9種培養基中，2個菌株在PDA和PSA上的生長最好，在PSA上的產孢量最多（表4）。

3? 討論

2017年11月在馬來西亞和印度尼西亞首次發現橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病，之后迅速蔓延。該病導致成熟葉片大量脫落，嚴重影響橡膠樹的光合作用，中小齡膠樹葉片脫落，枝條回枯，成齡膠樹減產50%以上[7]。據報道，在馬來西亞很多無性系種質如：RRIM2001、RRIM2025、RRIM2023、PB260和PB350均受害，且目前尚無田間抗性種質，截止2019年12月，該病已在馬來西亞的9個州發生為害[15]，并且在印度尼西亞、泰國、斯里蘭卡等主要植膠國爆發流行，潛在巨大威脅。2020年5—7月，筆者通過調查，在海南省樂東縣保顯農場發現了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的癥狀，通過形態學和分子系統學的鑒定最終確定采集的疑似病樣為Neopestalotiopsis aotearoa引起的橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病。該病目前在我國膠園尚未造成大面積為害，但也不能忽視其潛在的危害性。

新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）真菌是熱帶和亞熱帶地區廣泛存在的一類真菌。這類真菌的植物來源廣泛，寄主專一性不高，屬兼性寄生菌，以多種營養方式生存，且各種營養方式之間可以相互轉變，適應能力強，能夠引起多種植物的病害，是一種重要的植物病原菌[16]。據國內報道，該菌能侵染為害50多科植物，特別是茶等經濟作物和園林觀賞植物受害嚴重，能形成葉斑、葉枯、枝枯、根腐及果實潰瘍等癥狀，嚴重影響作物的產量、品質和觀賞性[17]。擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）是Steyeaer于1949年建立命名的，從盤多毛孢屬（Pestalotia）分離出來的分生孢子具5細胞的一個屬，按照新的分類系統，Pestalotiopsis屬于無性態真菌（Anamophic fungi），其有性態（Pestalosphaeria Margret﹠Barr）很難發現[18]。長期以來，擬盤多毛孢屬的分類及種的鑒定主要依據分生孢子形態特征來區分，但是培養基和培養條件會對分生孢子的形態特征產生一定影響，使得每個菌株的培養性狀存在一定的變化，主要表現在分生孢子的顏色、形態和附屬絲的長度等。僅僅依據形態學特征來鑒定擬盤多毛孢屬及其近緣屬，會導致種間界限嚴重重疊，不能準確反映系統關系，因此，結合形態學與分子系統學的手段，從遺傳進化上來分析擬盤多毛孢屬的多樣性，對其種和近緣種的鑒定更為準確[19]。

本研究基于國內新發擬盤多毛孢葉斑病菌的形態學，利用ITS、EF-1α和TUB 3個基因序列共同構建系統進化樹，將其病原鑒定為新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）的N. aotearoa。該菌最早于1954年在新西蘭Canvas發現的一種致病菌，它主要營兼性寄生生活，目前在其他作物上鮮有報道。從系統進化樹來看N. aotearoa分屬于N. piceana的一個分枝（圖7），遺傳距離較近，但在分生孢子的形態特征上存在明顯差異[14]。Febbiyanti等[20]報道的馬來西亞橡膠樹擬盤多毛孢病原為Pestalotiopsis sp.，暫未鑒定到種;Pornsuriya等[10]研究發現引起泰國橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的病原有N. cubana和N. formicarum。泰國和馬來西亞報道的橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病病原與我國的不是同一個種，推測是國內本地種侵染上來的，極可能適應國內的氣候環境，從病害的發病條件、爆發流行的環境因素、病原菌的適生性等方面都可能不同于泰國和馬來西亞病原，為此，研究國內菌株病原學就尤為重要。從基礎生物學特性分析結果來看，該菌喜酸性的環境條件，溫度高于35 ℃，低于10 ℃均不利于該菌生長，且高溫高濕有利于孢子的萌發。該病在田間的典型癥狀為病斑中央灰白色，邊緣黑褐色壞死線，周圍有明顯的黃色暈圈，這與Pornsuriya等[10]報道的泰國的基本一致。人工接種的葉片至第5天后能出現與田間自然發病相同的癥狀，但形成的壞死線和黃暈沒有田間自然發病條件下的明顯，保濕培養下能在病斑中央看到黑色的分生孢子群落。

橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病在我國屬于新發危險性病害，在亞洲主要植膠國已經造成了巨大的經濟損失，在國際上也備受關注。由于該病在各國的為害程度不一樣，管控措施也不相同，對該病的了解程度也不一樣，目前尚未形成防治該病的完整的技術體系。近年來，由于受國際天然橡膠市場價格的影響，橡膠產業經濟嚴重下滑，很多膠園都處于棄管狀態，新病害頻頻發生，次要病害也上升為主要病害，長此以往，病害的防治難度也將越來越大。因此，為了更好地應對、預防和控制該病在國內進一步的發生和為害，應積極探索病害的發生規律及流行條件，為提前儲備防治該病的相關技術措施提供理論依據。同時也呼吁廣大的橡膠生產單位、農場及相關科研人員，密切關注該病的發生、發展動態，及時掌握病害疫情，儲備相關防治技術措施，嚴防該病的進一步傳播與蔓延。

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