枯草芽孢桿菌Czk1與化學殺菌劑協(xié)同防治橡膠樹根病

謝立 賀春萍 梁艷瓊 李銳 翟純鑫 吳偉懷 鄭金龍 易克賢

摘? 要：為探究枯草芽孢桿菌與化學殺菌劑協(xié)同防治橡膠樹根病的可行性，為橡膠樹根病的可持續(xù)防治提供依據(jù)。采用抑菌圈法和平板菌落計數(shù)法分別測定7種殺菌劑和枯草芽孢桿菌Czk1菌株對橡膠樹紅根病菌、褐根病菌的毒力以及殺菌劑與Czk1菌的生物相容性，并用Horsfall法確定復配方案。結(jié)果表明：“根康”對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的EC50分別為0.6253、0.0522 μg/mL，EC50均最低且與Czk1菌有很好的生物相容性。“根康”（EC50=0.6253 μg/mL）與Czk1（EC50=6.46×107 CFU/mL）混配，體積比V（Czk1）∶V（“根康”）=7∶3時，對紅根病菌的增效比率值IR值為1.60;“根康”（EC50=0.0522 μg/mL）與生防菌Czk1（EC50=2.33×108 CFU/mL）混配，體積比V（Czk1）∶V（“根康”）=7∶3時，對褐根病菌IR值為1.51。研究表明，“根康”可與Czk1聯(lián)用協(xié)同防治橡膠樹根病，菌藥復配劑的防效明顯優(yōu)于單劑“根康”和單劑生防菌Czk1的防效，且混配劑中“根康”使用量只有單劑的1/3，大幅降低了化學藥劑的使用量。

關(guān)鍵詞：橡膠樹紅根病;橡膠樹褐根病;枯草芽孢桿菌;“根康”;協(xié)同防治

中圖分類號：S763.7? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： This study aimed to explore the potential of the synergistic control of rubber root diseases by Bacillus subtilis and chemical fungicides， and provide a basis for the sustainable prevention and control of rubber root diseases. The efficacy of seven fungicides and Czk1 strain against rubber red root disease and rubber brown root disease and the bio-compatibility of fungicides with Czk1 were determined by the inhibition zone and plate colony counting methods， while the combined effect was determined by the Horsfall method. The half-maximal inhibitor concentration （EC50） of “Gen Kang” on rubber red root disease and rubber brown root disease was 0.6253 μg/mL and 0.0522 μg/mL， respectively， which represented the lowest EC50 and showed good bio-compatibility with Czk1. “Gen Kang” （EC50=0.6253 μg/mL） was mixed with Czk1 （EC50=6.46×107 CFU/mL） in the volume ratio of 3∶7， respectively， against rubber red root disease and yielded IR value of 1.60， which was higher than the IR value of 1.51 that was obtained when “Gen Kang” （EC50=0.0522 μg/mL） was mixed with bio-control bacteria Czk1 （EC50=2.33×108 CFU/mL） in the same volume ratio. The results showed that “Gen Kang” could be used in combination with B. subtilis Czk1 to control rubber root disease as demonstrated by the significantly higher inhibitory effect obtained from their combined performance than when both “Gen Kang” and B. subtilis Czk1 strain were used independently. The use of “Gen Kang” in the mixture was only one-third （1/3） of that of single agent， which greatly reduced the use of chemical agents.

Keywords： rubber red root disease; rubber brown root disease; Bacillus subtilis; “Gen kang”; synergistic prevention

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.017

橡膠樹根病在世界各植膠區(qū)普遍發(fā)生，在我國以云南及海南植膠區(qū)發(fā)生尤為嚴重，該病主要通過根系接觸傳播，可由多種真菌侵染引起，為害根部，造成根部腐爛，最終導致植株枯萎死亡。國外報道橡膠樹上有8種根病為害，目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)有7種，分別為紅根病（Ganoderma pseudo fer reum （Wakef.） Over. et Steinm）、褐根病（Phellinus noxius （Corner） G. H. Cunn.）、紫根病（Helico basidium compactum Boed.）、臭根病（Sphaero stilbe repens Berk. et. Br.）、黑根病（Poria hypobrunnea Petch.）、黑紋根病（Ustulina deusta （Hoffm. et Fr.） Petrak）和白根病（Rigidoprus lignosus （KL.） Imaz），其中危害最大的是紅根病和褐根病。根病是限制我國橡膠單產(chǎn)提高的關(guān)鍵生物因子[1]。

目前，針對橡膠樹根病以物理防治和化學防治為主。然而，物理防治采取挖溝隔離只能起預防作用，且耗時費力，難以大范圍實施[2]。化學防治采用十三嗎啉藥劑灌根[3]，雖直接、有效，但存在成本高、長期使用防效下降及對膠林土壤生態(tài)不安全等問題[4]。生物防治安全、綠色環(huán)保，但其存在防效穩(wěn)定性差，顯效慢等缺陷，目前多數(shù)生防菌還停滯于實驗室分析階段，生產(chǎn)實踐中未得到大規(guī)模推廣和應用。目前針對橡膠樹根病生防菌的研究僅停留在拮抗菌的篩選、鑒定、生物學特性及抑菌物質(zhì)分析方面[5-6]，還未見在田間應用生防菌的報道。

生物?化學協(xié)同防治策略，既能減少化學農(nóng)藥的施用量，又可提高生物防治的穩(wěn)定性[7]，在植物病害防治領(lǐng)域日益受到重視并取得了良好效果[8]，但利用生防菌與化學藥劑協(xié)同防治橡膠樹根病的研究尚未見報道。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Czk1是一株對多種真菌病害具拮抗作用的生防細菌，其代謝產(chǎn)物對橡膠樹紅根病（G. pseudoferreum）、褐根病（P. noxius）、紫根病（H. compactum）、臭根病（S. repens）、白根病（R. lignosus）、炭疽病（Colletortrichum gloeosporioides Penz.）等病害具有顯著防治效果[9-12]。為明確Czk1與生產(chǎn)上常用的化學藥劑的相容性，本研究擬探討化學藥劑與枯草芽孢桿菌Czk1協(xié)同防治橡膠樹根病的效果，篩選出可與Czk1聯(lián)用的化學藥劑并進行復配，以期為生防制劑的開發(fā)利用提供技術(shù)支持，這對橡膠樹根病的可持續(xù)防治具有重要的實際應用價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株：枯草芽孢桿菌（B. subtilis） Czk1，橡膠樹根病病原菌：橡膠樹紅根病菌（G. pseudoferreum） Gp030，褐根病菌（P. noxius） Pn006，均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶特色經(jīng)濟作物病害課題組分離、鑒定和保存。

培養(yǎng)基：改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar， PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 L;Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，液體培養(yǎng)基用蒸餾水定容至1 L;固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20 g再用蒸餾水定容至1 L。

供試藥劑：戊唑醇、丙環(huán)唑、百菌清、三唑酮、十三嗎啉、咪鮮胺、“根康”[13]，7種化學藥劑的含量、劑型、生產(chǎn)廠家及供試濃度見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 7種化學農(nóng)藥對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的毒力測定? 采用菌絲生長速率法，將表1中7種殺菌劑分別配成不同質(zhì)量濃度的PDA培養(yǎng)基平板，分別將紅根病菌、褐根病菌菌餅（直徑6 mm）接入含藥平板，以加等量無菌水為空白對照（CK），每個處理5次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照菌落長滿培養(yǎng)皿1/2～2/3時，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算平均抑制率：

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-6 mm）×100%。

1.2.2? 枯草芽孢桿菌Czk1最佳搖菌時間的測定和Czk1菌液最佳稀釋濃度的篩選? 挑取Czk1菌株單菌落放入LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)10、12、14 h，分別測量其OD600值;采用系列梯度稀釋法，將Czk1菌液稀釋至104、105、106進行涂布，計算其菌落生長數(shù)量。確定最佳稀釋濃度和最佳搖菌時間（菌落生長數(shù)量為30～300個，且菌落大小無明顯差異）。

1.2.3? Czk1與化學藥劑的生物相容性測定? 將上述7種殺菌劑分別配制成濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的含藥LB培養(yǎng)基平板。用移液器吸取100 μL枯草芽孢桿菌Czk1的菌懸液均勻涂布于含藥培養(yǎng)基表面，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2、5、10 d時采用平板稀釋法檢測菌體生長情況，統(tǒng)計并記錄菌落數(shù)量，并取樣涂片檢查孢子萌發(fā)情況。以加等量無菌水為空白對照（CK），每個處理5次重復。

1.2.4? 單劑對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的毒力測定? 將單劑枯草芽孢桿菌Czk1搖菌12 h后，測量其發(fā)酵液OD600值并配制成以下6個含菌量，分別是1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1× 1010 CFU/mL（CFU為菌落形成單位，即為菌落的計數(shù)）。采用平板對峙法的濾紙片法：將滅菌的PDA固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，待平板凝固后，用直徑為6 mm的滅菌打孔器分別取橡膠樹紅根病菌、橡膠樹褐根病菌邊緣菌餅放入平板中央。將已吸附1 μL菌液的4張濾紙片（直徑1 cm）呈“十”字狀排列放置于距離培養(yǎng)皿中心點3 cm處。以加入等量無菌水為空白對照（CK），每個處理5次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。采用十字交叉法測量各含菌平板的菌落直徑，計算平均抑制率。將抑制百分率換算成抑制幾率值（y）。根據(jù)藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)（x）與抑制機率值（y），求得回歸方程y=ax+b，并計算各藥劑的抑制中濃度EC50、EC75及相關(guān)系數(shù)r值。

1.2.5? 復配劑對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的毒力測定? 根據(jù)單劑毒力測定結(jié)果，以對橡膠樹紅根病菌和橡膠樹褐根病菌最佳抑制效果的殺菌劑與枯草芽孢桿菌Czk1 2種單劑的有效中質(zhì)量濃度EC50為基礎(chǔ)，配制2種單劑的有效中質(zhì)量濃度藥液。再按體積比V（生防菌Czk1）∶V（化學藥劑）=0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0不同配比進行復配。采用菌絲生長速率法，將以上不同配比的復配劑分別配成含藥PDA培養(yǎng)基平板，分別將紅根病菌、褐根病菌菌餅（直徑6 mm）接入含藥平板，以加入等量無菌水為空白對照（CK），每個處理5次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照菌落長滿培養(yǎng)皿1/2～2/3時，采用十字交叉法測量各配方平板的菌落直徑，計算平均抑制率、理論抑制生長率。用Horsfall法進行聯(lián)合毒力增效計算，根據(jù)增效比率值IR，判斷不同配方的協(xié)同作用效果。若增效比率IR>1為增效作用;IR=1為加和作用;IR<1為拮抗作用[14]。其計算公式為：IR=Eab/Eth。

式中：Eab為混劑的實際防治效果;Eth為混劑的理論防治效果。

Eab=復配劑對橡膠樹根病菌的抑菌率;Eth=生防菌Czk1菌懸液EC50劑量實際控制率×配比中的百分率+抑菌最佳殺菌劑EC50劑量實際控制率×配比中的百分率[15]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0、JMP10.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncans新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 7種化學殺菌劑對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的毒力測定分析

由表2可知，7種化學殺菌劑均對橡膠樹紅根病菌Gp030、褐根病菌Pn006產(chǎn)生不同程度的抑制作用，藥劑的毒力均隨藥劑質(zhì)量濃度的增加而增強，但不同藥劑對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的抑制效果不同，7種藥劑的毒力大小依次為“根康”、戊唑醇、百菌清、丙環(huán)唑、十三嗎啉、三唑酮、咪鮮胺。對于橡膠樹紅根病菌Gp030，抑制中質(zhì)量濃度EC50值介于0.6253～6.1754 μg/mL之間，對于橡膠樹褐根病菌Pn006，抑制中質(zhì)量濃度EC50值介于0.0522～0.5202 μg/mL之間。在較低質(zhì)量濃度（EC50<1 μg/mL）下對2種根病病原菌均具有較好抑制效果的化學藥劑是：“根康”、戊唑醇和百菌清。

2.2? 枯草芽孢桿菌Czk1與化學藥劑的相容性分析

2.2.1? Czk1菌液最佳稀釋濃度的測定? 通過系列平板稀釋涂布法對Czk1菌液3個稀釋倍數(shù)濃度在10、12、14 h分別進行OD600值測定和菌落數(shù)量統(tǒng)計（表3），可得出如下結(jié)論：Czk1菌株振蕩培養(yǎng)12 h菌液OD600值最大，為2.137，培養(yǎng)10 h OD600值最小，為1.572。當菌液稀釋倍數(shù)為104時，10、12 h培養(yǎng)皿上菌落數(shù)多至無法計算，14 h時含菌量為1.21×107 CFU/mL;當菌液稀釋倍數(shù)為105時，10、12 h其含菌量分別為1.19× 108、1.20×108 CFU/mL，14 h含菌量降至4.53× 107 CFU/mL;當菌液稀釋倍數(shù)為106時，10、14 h其含菌量分別為5.67×107、6.33×107 CFU/mL，12 h含菌量為4.07×108 CFU/mL。通過實驗，最終確認Czk1菌液稀釋至105倍搖菌12 h其菌落數(shù)量較多且菌落大小穩(wěn)定，含菌量較多。

2.2.2? Czk1與化學藥劑的相容性測定? 通過測定7種化學藥劑對枯草芽孢桿菌Czk1菌落形成、孢子萌發(fā)的影響，表明7種化學藥劑對枯草芽孢桿菌Czk1的生物相容性差異較大（表4）。7種化學藥劑與生防菌Czk1的相容性均較好，當制劑含量為0.05～0.25 μg/mL時，生防菌均能正常生長;其中以“根康”與生防菌Czk1的相容性最好，當質(zhì)量濃度在0.25～1.00 μg/mL時，生防菌除能在平板上正常生長外，其菌落數(shù)均比對照多;其次為三唑酮和丙環(huán)唑，當制劑的質(zhì)量濃度為0.05～0.50 μg/mL時，生防菌在平板上可以正常生長，當質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的含藥平板上時除可以生長外，其菌落數(shù)比對照多;再次為咪鮮胺、十三嗎啉、戊唑醇，當制劑的質(zhì)量濃度為0.50 μg/mL時，生防菌在平板上可以正常生長，但在1.00 μg/mL的含藥平板上雖然可以生長，但比對照的菌落數(shù)少;而在百菌清平板上，當制劑含量為0.10 μg/mL時，生防菌可以生長，但在0.50 μg/mL時菌落停止生長。綜合考慮7種藥劑對橡膠樹根病病菌的抑制效果及與生防菌的生物相容性，選擇“根康”作為菌藥復配劑的化學因子。

2.3? “根康”與枯草芽孢桿菌Czk1復配劑的毒力分析

2.3.1? 單劑對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌的毒力測定? 由表2可知，“根康”對橡膠樹紅根病菌Gp030和褐根病菌Pn006的抑制有效中濃度EC50分別為0.6253、0.0522 μg/mL。單劑枯草芽孢桿菌Czk1菌液對橡膠樹紅根病菌Gp030和橡膠樹褐根病菌Pn006的毒力測定結(jié)果見表5，枯草芽孢桿菌Czk1菌液對橡膠樹褐根病菌Pn006的抑制中菌落數(shù)量為2.33×108 CFU/mL，對橡膠樹紅根病菌Gp030的抑制中菌落數(shù)為6.46× 107 CFU/mL。

2.3.2? 復配劑對橡膠樹紅根病菌和橡膠樹褐根病菌的聯(lián)合毒力測定? 根據(jù)以上試驗結(jié)果，將0.6253 μg/mL“根康”與6.46×107 CFU/mL枯草芽孢桿菌Czk1發(fā)酵液以不同體積比進行復配，二者聯(lián)合對橡膠樹紅根病菌Gp030的毒力測定結(jié)果見表6，當Czk1與“根康”體積比分別為4∶6、5∶5、6∶4和7∶3時有明顯增效作用，實際防治效果分別為57.14%、64.79%、71.03%、76.66%;其中當其體積比為7∶3時，增效作用最強，防效最好。將0.0522 μg/mL“根康”與2.33×108 CFU/mL枯草芽孢桿菌Czk1發(fā)酵液以不同體積比進行復配，二者聯(lián)合對橡膠樹褐根病菌Pn006的毒力測定結(jié)果從表6中可看出，當Czk1與“根康”體積比分別為2∶8、3∶7、4∶6、7∶3和9∶1時具有明顯增效作用，實際防治效果分別為82.04%、80.42%、81.07%、89.32%、85.28%;其中當其體積比為7∶3時，增效作用最強，防效最好。同時對2種根病病菌表現(xiàn)為明顯增效作用的復配比例有V（Czk1）∶V（“根康”）=4∶6、7∶3。綜合考慮增效比值IR的高低，復配比例為7﹕3時的增效值IR相對高于4∶6，因此選取V（Czk1）∶V（“根康”）=7∶3作為復配的最佳配比。

3? 討論

根病是橡膠生產(chǎn)上三大毀滅性病害之一，病害主要通過根系接觸傳播，染病植株從葉片黃化到植株枯死往往僅需半個月至一年，嚴重影響橡膠的品質(zhì)和產(chǎn)量，對天然橡膠產(chǎn)業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。目前國內(nèi)對橡膠樹根病的研究多限于病原菌的鑒定、生物學特性研究、殺菌劑室內(nèi)毒力測定及篩選[16-17]，在利用生防菌防治橡膠樹根病方面僅有一些室內(nèi)生防菌篩選和拮抗實驗，均未進行菌藥協(xié)同和田間實驗[18-20]，生物?化學協(xié)同防治這一新的防治策略在指導橡膠樹根病防治中具有重大意義。

本研究通過7種化學藥劑對橡膠樹紅根病菌Gp030和橡膠樹褐根病菌Pn006的毒力測定表明，“根康”、戊唑醇三唑類殺菌劑對2種病原菌的抑菌效果最好，對橡膠樹紅根病菌Gp030的EC50值分別為0.6253、0.7266 μg/mL，對橡膠樹褐根病菌Pn006的EC50值分別為0.0522、0.0778 ug/mL，說明三唑類殺菌劑在濃度低于0.10 μg/mL時對橡膠樹褐根病菌的抑菌效果更好，而紅根病菌的抗藥性較強。其次為百菌清，百菌清為芳烴類保護性廣譜殺菌劑，對橡膠樹褐根病菌Pn006和橡膠樹紅根病菌Gp030的抑菌效果優(yōu)于十三嗎啉、丙環(huán)唑，這與賀春萍等[21]報道的十三嗎啉、三唑酮對紅根病菌抑菌效果優(yōu)于百菌清的研究結(jié)果有些差異，這可能與參試的不同紅根病菌菌株對相同化學藥劑敏感性差異有關(guān)。

通過實驗測定枯草芽孢桿菌Czk1最佳搖菌時間發(fā)現(xiàn)，當搖菌時間為12 h時，菌落數(shù)量較多且菌落大小相差不大。當搖菌時間在10 h時，菌落還有生長空間，可以繼續(xù)分裂生長，OD600值較小。當時間超過14 h時，搖瓶內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不足以繼續(xù)供應Czk1的分裂生長，產(chǎn)生的菌落中有許多死細胞，雖然菌液OD600值較高，但活菌數(shù)含量并不多。枯草芽孢桿菌Czk1與三唑類殺菌劑相容性均較好，其中相容性最好的藥劑是“根康”，而廣譜性殺菌劑百菌清與Czk1的相容性較差。

利用生防微生物與化學藥劑協(xié)同防治植物病害具有明顯的增效作用[22-23]，近年來采用生物?化學藥劑協(xié)同防治植物土傳病害的相關(guān)研究報道較多[24-25]，但應用于防治橡膠樹根病的研究還未見報道。目前生產(chǎn)上對橡膠樹根病的防治主要采用化學防治的方法，本研究突破以化學藥劑為主防治橡膠樹根病的局限性，嘗試利用生防微生物與低毒化學藥劑協(xié)同防治橡膠樹根病。研究表明枯草芽孢桿菌Czk1發(fā)酵液與“根康”按7∶3體積比進行復配，對橡膠樹紅根病病菌以及褐根病病菌的抑制有明顯的增效作用，0.6253 μg/mL“根康”與6.46×107 CFU/mL Czk1發(fā)酵液混配劑對紅根病病菌的增效比率為1.60，0.0522 μg/mL “根康”與2.33×108 CFU/mL Czk1發(fā)酵液混配劑對褐根病病菌的增效比率為1.51，防治效果均明顯高于2個單劑Czk1和“根康”，而且復配劑中化學藥劑“根康”的使用量僅為正常施用量的1/3。因此，在提高防效的同時還有效減少了化學農(nóng)藥的使用量，彌補了生防微生物抗菌譜窄、防效緩慢等缺陷，延緩了病原菌對化學藥劑的抗藥性，提高了生防菌防效的穩(wěn)定性，實現(xiàn)了對多種病害的兼治作用與持續(xù)效果[26]。而化學藥劑有助于生防微生物克服自然環(huán)境中習居微生物（包括病原菌）的排斥作用，使其能在各種自然生態(tài)環(huán)境中順利定殖，形成優(yōu)勢種群和足夠的群體數(shù)量，以更好地發(fā)揮其生物防治作用[27-28]。研究結(jié)果在生產(chǎn)上對于橡膠樹根病的可持續(xù)性防治具有十分重要的應用價值和指導意義。雖然室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明菌藥復配對根病防治有明顯的增效作用，但還需進一步研究菌藥聯(lián)用的增效作用機制和田間防效。

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