枝孢霉菌對噴氣燃料性質的影響及降解烷烴機理

牛明明，蘇 鵬，熊 云，許世海，孫新楓

(陸軍勤務學院，重慶 401331)

微生物能夠利用噴氣燃料儲運設施中殘留的水分，以烴類化合物為碳源，以胺型抗氧劑、抗靜電劑等添加劑及燃料中含有的氮、硫等元素為營養物質進行生長繁殖[1-2]。

微生物的生長繁殖會降解燃料組分和添加劑，影響燃料性質。其生長過程中分泌的表面活性物質、降解烴類化合物產生的酸性物質會影響燃料的潔凈性和腐蝕性。研究表明[3]，真菌在生長代謝過程中會分泌出如糖類化合物、多糖脂、脂肽等表面活性物質。如Seghal等[4]在海洋中分離出MSF3真菌，通過溶血實驗、液滴坍塌試壓和驅油實驗等方法檢測到該菌在生長繁殖過程中產生了表面活性物質，分析表明該表面活性物質為糖脂蛋白。這些表面活性物質可以降低噴氣燃料和培養基相界面的表面張力，促使噴氣燃料與水相乳化。

噴氣燃料銀片腐蝕主要原因在于活性硫化物作用[5-7]。研究表明[5]，硫酸鹽還原菌能將非活性硫化物轉化為活性硫化物，是噴氣燃料微生物腐蝕性的主要微生物。朱俊忠等[7]采用燃燈法定期考察了噴氣燃料在硫酸鹽還原菌生長繁殖過程中活性硫化物含量的變化，發現隨著該菌生長時間的延長，噴氣燃料中活性硫化物含量不斷增加。同時，崔艷雨等[8]、龍泉芝等[9-10]分別研究了真菌對噴氣燃料性質的影響，認為真菌對噴氣燃料外觀、顆粒度、總酸值的影響較為明顯。此外，真菌菌絲相互勾連形成的懸浮物和菌絲聚集形成的生物膜會堵塞過濾器，干擾燃料計量系統，影響飛行安全[11-13]。

為了監控噴氣燃料中微生物的生長，防治微生物污染，國際航空運輸協會(IATA)和美國材料與實驗協會(ASTM)等機構指定了噴氣燃料中微生物的檢測標準方法，制定了微生物污染等級標準[14-15]。楊浩[16]、李鵬[17]通過基因測序對噴氣燃料中的真菌菌種進行了鑒定，認為枝孢霉菌(AmorphothecaResinae)是中國噴氣燃料中的優勢真菌菌種，即特征真菌。

目前，關于真菌對噴氣燃料性質影響的研究，多數只考察了實驗始末階段噴氣燃料性質發生的變化，而未研究噴氣燃料性質在真菌生長各階段發生的變化，不能有效為真菌污染的預警和預防提供依據；同時，在以噴氣燃料為唯一碳源條件下，真菌對噴氣燃料烴類化合物的降解產物、降解機理以及造成噴氣燃料性質改變的原因等方面尚不明確。因此，筆者以中國噴氣燃料中的特征真菌枝孢霉菌為對象，考察了其生長過程對噴氣燃料性質的影響，及其對噴氣燃料替代物正十二烷的降解機理，為中國噴氣燃料的使用、儲存和性能優化提供參考。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

枝孢霉菌(AmorphothecaResinae)，菌株編號為2543，中國工業微生物菌種保藏管理中心提供；氫氧化鉀、異丙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖、無水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸氫二銨、氯化鈉、酚酞、無水乙醇，均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司；α-萘酚醌苯基甲烷(對萘酚苯)，購自上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；硝酸鉀，分析純，購自重慶北碚化學試劑廠；六水三氯化鐵，分析純，購自山東西亞化學工業有限公司；正十二烷、正己烷，色譜純，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

Bushnell Haas (BH)培養基主要組分為：0.2 g硫酸鎂、0.0265 g二水氯化鈣、1 g磷酸二氫鉀、1 g 磷酸氫二銨、1 g硝酸鉀、0.083 g六水三氯化鐵、1 L去離子水。培養基的pH值通過0.10 mol/L的KOH溶液和3.0 mol/L的鹽酸溶液調節；鈉元素濃度通過氯化鈉調整。

1.2 儀器

美國Thermo Fisher公司ECO 1.2超凈工作臺；日本TOMY Digital Biology公司SX-300快速自動高壓滅菌器；美國Agilent Technologies公司7890A氣相色譜儀(GC)；美國Agilent Technologies公司7890A/5957C氣質聯用儀(GC/MS)；承德鼎盛實驗機檢測設備有限公司JYW-200C全自動表界面張力儀；南京陵武新技術應用開發研究中心NJ-1A石油產品腐蝕實驗多用儀；上海儀電科學儀器股份有限公司PHBJ-260雷磁便攜式pH計；鹽城市凱特實驗儀器有限公司TG16G高速離心機；玻璃砂芯過濾裝置(上海市新亞凈化器件廠0.22 μm濾膜)。

1.3 實驗過程

1.3.1 枝孢霉菌生長條件的考察

為了解枝孢霉菌生長繁殖過程，控制噴氣燃料儲用條件，抑制真菌生長及其對燃料性質的影響，依據ASTM提出的燃料儲存環境和真菌適宜生長范圍，以菌絲干重為指標，以生長溫度(A)、初始pH值(B)和鈉元素濃度(C)為因素，按照正交實驗設計(見表1)考察影響枝孢霉菌生長繁殖的關鍵因素：在9個錐形瓶中分別加入40 mL BH培養基，調節其初始pH值和鈉元素濃度，滅菌(120 ℃、20 min)后在無菌環境中加入1 mL正十二烷、400 μL枝孢霉菌菌液，置于不同溫度的恒溫振蕩器中以170 r/min振蕩生長5 d，稱取菌絲干重，分析實驗結果。

稱取菌絲干重方法：將培養液離心(8000 r/min、10 min)，取菌絲，清洗后烘干2 h(80 ℃)[18]，干燥、冷卻30 min，稱重；再次烘干、冷卻、稱重，直至兩次稱重誤差小于0.3 mg。

1.3.2 噴氣燃料性能試驗

在超凈工作臺中，將700 mL經過濾除菌的 3號噴氣燃料、200 mL滅菌的BH培養基(最佳生長條件)和1 mL枝孢霉菌菌液分別加入試劑瓶，構建以噴氣燃料為唯一碳源的生長體系。同時，設置空白實驗。將試劑瓶置于25 ℃水浴恒溫生長，每天于敞開式搖床中以170 r/min振蕩生長45 min。

每隔2 d在油-水界面上方1～2 cm處取噴氣燃料油樣，按照《噴氣燃料銀片腐蝕快速試驗法(原電池法)》(YLB 08—2001)、《噴氣燃料總酸值測定法》(GB/T 12574—1990)、《航空燃料水反應試驗法》(GB/T 1793—2008)和《表面活性劑表面張力的測定》(GB/T 22237—2008)分別進行銀片腐蝕試驗、總酸值測定、水反應試驗和表面張力測定，判斷枝孢霉菌在生長過程中對噴氣燃料腐蝕性、潔凈性的影響。

1.4 枝孢霉菌生長規律及其正十二烷降解產物的測定

在三角燒瓶中加入100 mL BH培養基，滅菌后加入2 mL正十二烷[19-20]、1 mL枝孢霉菌菌液，封口后置于恒溫振蕩器中生長(25 ℃，170 r/min)，構建以噴氣燃料替代物正十二烷為唯一碳源的生長體系。每隔1 d取1個樣品，用氣相色譜測定正十二烷降解率[21]；用氣-質聯用儀檢測枝孢霉菌降解正十二烷的中間產物；以菌絲干重為指標研究枝孢霉菌生長規律，繪制其生長曲線。

正十二烷降解率測定的GC條件為：HP-5色譜柱(30 m×250 μm×0.25μm)，載氣(N2)流速為30 cm/s，進口溫度為280 ℃，FID檢測器溫度為300 ℃，進口分流比為10∶1，進樣量2 μL，初始柱溫60 ℃保留1 min，再以15 ℃/min升溫至240 ℃，最后以10 ℃/min升溫至300 ℃保留1 min。

中間產物測定的GC運行條件為：HP-5色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，初始柱溫60 ℃保留1 min，再以15 ℃/min升溫至240 ℃，最后以 10 ℃/min 升溫至300 ℃保留1 min。中間產物測定的MS運行條件為：接口溫度260 ℃，電子能量 70 eV，電離方式為EI，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描范圍(m/z)為50～400。

2 結果與討論

2.1 環境因素對枝孢霉菌生長的影響

以菌絲干重為指標，枝孢霉菌生長條件優化的正交實驗設計結果見表1；實驗結果的極差(Range)分析和方差(FRation)分析見表2。由表1可知，3號實驗菌絲干重最大，故A1B3C3組合是枝孢霉菌適宜的生長條件，即：生長溫度為25 ℃、初始pH值為8.0、鈉元素質量濃度為200.0 mg/L。

極差分析和方差分析分別表征實驗因素對實驗結果影響大小和顯著程度。因素極差越大，則對實驗結果的影響越大；因素F值大于F0.05時，則該因素的改變對實驗結果有顯著的影響[22]。由表2可知：B因素極差與方差最大；A、C因素極差很小，方差也較小。因此，對于枝孢霉菌生長，環境pH值的影響最大、最顯著；溫度和鈉元素濃度的影響較小，而無顯著性。

表1 正交實驗結果

為驗證篩選生長條件的可靠性，深入掌握枝孢霉菌的生長規律，為噴氣燃料中真菌的控制提供依據，分別在最優生長條件組合A1B3C3和次優生長條件組合A1B2C2下培養枝孢霉菌。枝孢霉菌生長繁殖曲線如圖1所示。由圖1可知，不同條件下，枝孢霉菌的生長趨勢基本一致，即菌絲干重經歷了先下降，然后迅速上升，再保持相對平穩。枝孢霉菌接入培養基初期，由于培養基缺乏充足的酶和中間代謝產物，需要一個短暫的適應期，即為枝孢霉菌生長的遲緩期(1～2 d)。遲緩期內，枝孢霉菌繁殖速率較為緩慢，菌絲干重略有下降，但代謝活躍，為下階段生長繁殖儲備了充足的酶、能量和中間產物。從第2 d開始，枝孢霉菌進入快速生長繁殖期(指數期)，菌絲干重快速增加，第5 d時達到最大值。之后，枝孢霉菌的生長繁殖進入穩定期。原因在于，隨著枝孢霉菌的生長，生長體系中營養物質不斷被消耗、有機酸等毒性代謝產物不斷積累、培養基pH值下降，導致枝孢霉菌的繁殖速率下降，死亡數目上升，而趨于平衡。

表2 正交數據處理結果

圖1 正交實驗結果驗證實驗圖

另外，由圖1還可以看出，在最優生長條件下，枝孢霉菌生長繁殖更快，菌絲干重更大，證明了正交實驗結果的可靠性。

2.2 枝孢霉菌對噴氣燃料銀片腐蝕試驗的影響

在以噴氣燃料為唯一碳源的生長體系中，枝孢霉菌生長22 d后噴氣燃料銀片腐蝕試驗前后的銀片如圖2所示。由圖2可知，試驗后銀片未出現明顯變化，保持自身金屬光澤，無腐蝕斑點。這說明枝孢霉菌的生長過程中不會將培養基中的非活性硫化物(硫酸鎂等)轉化為活性硫化物，對噴氣燃料銀片腐蝕試驗結果無影響，不會增加噴氣燃料對銀的腐蝕性。枝孢霉菌不能將非活性硫化物轉化為活性硫化物，是因為其沒有降解非活性硫化物的基因，不能分泌促使非活性硫化物降解的酶，不能有效攝取非活性硫化物或調控進行降解非活性硫化物的氧化反應。

圖2 銀片腐蝕試驗前后銀片外觀

2.3 枝孢霉菌對噴氣燃料總酸值的影響

枝孢霉菌生長繁殖過程中，噴氣燃料總酸值(At)變化如圖3所示。由圖3可知：隨著枝孢霉菌生長時間的延長，噴氣燃料總酸值呈增加趨勢；培養22 d后，噴氣燃料總酸值超出了《3號噴氣燃料》(GB 6537—2018)標準規定的限值0.015 mg KOH/g，底部噴氣燃料已不合格；空白試驗中噴氣燃料總酸值在實驗過程中均在0.005 mg KOH/g左右，未發生明顯變化，且均在標準規定范圍內。

圖3 噴氣燃料總酸值變化曲線

實驗結果表明，枝孢霉菌在噴氣燃料中生長繁殖的過程中產生了酸性物質。產生的大分子有機酸進入了噴氣燃料，升高了噴氣燃料總酸值。噴氣燃料總酸值的增加，會增大噴氣燃料對燃料儲存、運輸以及使用過程中所接觸部分金屬的腐蝕性，影響設備使用壽命。

2.4 枝孢霉菌對噴氣燃料表面張力及其水反應實驗結果的影響

噴氣燃料和培養基表面張力(Fst)變化曲線見圖4。由圖4可知，枝孢霉菌在生長繁殖過程中，噴氣燃料和培養基表面張力總體上均呈下降趨勢，分別下降了2.39%和14.19%，且后者表面張力下降幅度比前者更大。這說明枝孢霉菌在生長代謝過程中分泌出了表面活性物質，引起兩相表面張力的下降，且該表面活性物質使水相的表面張力變化更大。原因在于，噴氣燃料在水中的溶解度很小，很難被枝孢霉菌接觸、攝取和利用，因此枝孢霉菌分泌出表面活性物質，使少量油-水兩相乳化。這樣可以將部分烴分子以微小液滴均勻分布在乳化液內[23]，有效增加了微生物與烴類物質的接觸，促進其對烴類分子的吸收利用[24]。

圖4 噴氣燃料和培養基表面張力變化曲線

此外，噴氣燃料水反應試驗結果表明，噴氣燃料和水兩相沒有乳化或沉淀，相界面清晰、清潔，油-水分離程度和界面現象均符合標準要求。這表明枝孢霉菌代謝繁殖產生的表面活性物質，雖然降低了噴氣燃料的表面張力，但因產生的表面活性物質數量較少，界面處兩相(尤其是噴氣燃料)表面張力下降幅度有限，引起兩相的乳化程度不大，因而未影響噴氣燃料水反應試驗的結果。

2.5 枝孢霉菌降解正十二烷規律及其生長曲線

生長體系中正十二烷降解率和枝孢霉菌菌絲干重變化曲線見圖5。由圖5可知，隨枝孢霉菌生長時間的延長，生長體系中正十二烷不斷被消耗。初期(0～3 d)正十二烷消耗較慢，后期消耗明顯加快，原因在于生長初期體系中枝孢霉菌數量較少，后期枝孢霉菌數量顯著增加。枝孢霉菌菌絲干重在遲緩期明顯下降，指數期迅速增加，然后再次下降。這是因為遲緩期內，因生長所需的酶等中間產物的缺乏導致枝孢霉菌生長緩慢；快速生長的指數期內，酶等中間產物豐富，枝孢霉菌生長繁殖速率顯著加快；指數期后，隨著枝孢霉菌的快速生長繁殖，生長體系中的碳源等營養物質不斷被消耗，毒性物質不斷積累，枝孢霉菌的繁殖數量下降，而死亡數目上升，最終枝孢霉菌死亡數目超過繁殖數目，枝孢霉菌進入數量減少的衰亡期，菌絲干重開始下降。正十二烷的降解消耗量與枝孢霉菌生長量基本保持一致，說明枝孢霉菌以正十二烷為碳源生長繁殖。

圖5 正十二烷降解率及菌絲干重變化曲線

2.6 枝孢霉菌降解十二烷的機理

采用GC-MS對正十二烷降解體系的各物質進行檢測。共檢測到4種物質：2-十二碳烯(C12H24)、2-十二碳烯-1-醇(C12H24O)、2-十二碳烯酸(C12H22O2)和4-羥基丁酸(C4H8O3)。其中，前3種物質在油相中，其質譜圖分別見圖6、圖7和圖8；C4H8O3則進入了水相。由此可知，枝孢霉菌降解噴氣燃料產生的有機酸進入噴氣燃料，使噴氣燃料總酸值升高，增加噴氣燃料的腐蝕性。但有機酸的酸性較低，且其中無活性硫組分，因而對噴氣燃料銀片腐蝕試驗沒有影響；雖然有機酸作為表面活性物質能引起噴氣燃料與水界面的表面張力下降，但因其數量有限，對噴氣燃料水反應試驗也未產生明顯影響。由圖6可知：最大質荷比的峰m/z為168，下一個質荷比的峰m/z為139，二者相差29，對應為乙基，且m/z為偶數，符合氮律，初步判斷m/z=168為分子離子峰，分子式可能為C12H24；下一個質荷比的峰m/z為125，與139相差14，對應為亞甲基；在m/z為43之前峰均與前一個峰的質荷比相差14(亞甲基)；m/z=43和m/z=29的峰分別為正丙基和乙基的峰；m/z=41的峰判斷為CH3-CH=CH，因而可以確定雙鍵在2號位；m/z=89可能為雜質峰。因此，可以進一步判斷該物質為2-十二碳烯(C12H24)。按以上方法，判斷圖7、圖8對應的物質分別為2-十二碳烯-1-醇和2-十二碳烯酸。

圖6 2-十二碳烯質譜圖

圖7 2-十二碳烯-1-醇質譜圖

圖8 2-十二碳烯酸質譜圖

Rojo等[25-27]認為，微生物在有氧環境下降解烷烴的途徑有單末端氧化、雙末端氧化和次末端氧化3種，且均是在酶參與下的酶促反應。單末端氧化的第一步是烷烴在酶的作用下將氧原子引入烴的末端甲基形成伯醇，然后伯醇在酶的作用下依次被氧化成醛和羧酸，然后羧酸進入β-氧化，先后生成、去除乙酰輔酶-A，生成減少2個碳原子的烴類，重復以上過程，直至最后生成CO2和H2O。雙末端氧化是指烷烴在酶的作用下，同時將2個末端甲基氧化為伯醇，然后依次將其氧化為醛和羧酸，并進入β-氧化；次末端氧化時，烷烴在酶的作用下，先被氧化為仲醇，然后依次被氧化為酮和酯，其中酯又水解為醇和脂肪酸。

根據檢測到的中間產物，可推斷枝孢霉菌對正十二烷的降解是單末端氧化。即，在酶的作用下，枝孢霉菌先將正十二烷氧化為伯醇，再將伯醇氧化為醛，然后氧化為羧酸。枝孢霉菌對正十二烷的氧化降解機理見圖9。其中，GC-MS并沒有檢測到醛存在，可能是因為醛作為氧化中間產物，其氧化成酸的步驟快速，在體系中存在的時間很短，從而未被萃取到或未被MS捕捉到。

圖9 正十二烷氧化降解機理

3 結 論

(1)枝孢霉菌的最佳生長條件是25 ℃、培養基初始pH值為8.0、鈉元素質量濃度為200.0 mg/L，其中對其生長影響較大的是培養基pH值。在噴氣燃料儲用過程中，應避免該環境。

(2)枝孢霉菌在噴氣燃料中生長繁殖，能顯著升高噴氣燃料總酸值，降低其表面張力，但對噴氣燃料銀片腐蝕試驗結果和水反應試驗結果沒有明顯影響。

(3)枝孢霉菌以正十二烷為唯一碳源進行生長繁殖過程中，通過單末端氧化途徑降解正十二烷，并依次將其氧化為2-十二碳烯、2-十二碳烯-1-醇、2-十二碳烯酸和4-羥基丁酸等物質。