基于網絡藥理學和分子對接探討葛根-丹參藥對治療2型糖尿病作用機制研究＊

羅新新 ，劉玲 ，吳文明 ，劉靜 ，胡建新

（1.江西省人民醫(yī)院藥學部，南昌 330006；2.南昌大學附屬人民醫(yī)院藥學部，南昌 330006；3.江西省腫瘤醫(yī)院藥學部，南昌330096）

2 型糖尿病 （Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM）是一種慢性代謝性疾病,主要是與肥胖和周圍組織中脂質聚集有關,胰島素β 細胞中的脂質堆積和脂毒性會導致胰島β 細胞功能障礙引起血糖水平升高，糖耐量異常，臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)性高血糖[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟 （International Diabetes Federation, IDF)統(tǒng)計，中國糖尿病患者位居第一，約為1.146 億人, 近5 年江西成人糖尿病患病率高達9.5%,呈上升趨勢,糖尿病帶來的社會經濟負擔是巨大的[2]。 目前T2DM 藥物的的治療主要采用方法為：胰島素皮下注射，口服降糖藥物（如：雙胍類、磺酰脲類、α 糖苷酶抑制劑等）等方式，但隨著病情的發(fā)展， 單靶點研發(fā)的藥物難以治療T2DM 及阻止并發(fā)癥的發(fā)生。 中藥治療T2DM 通過單靶點疊加作用、多成分多靶點協(xié)同作用、毒性分散效應從而達到較好的療效及更低的毒性[3]，中醫(yī)藥治療是從一個整體實現(xiàn)多維調控的復雜理論體系， 與網絡藥理學基于成分-靶點-疾病互作網絡分析藥物的作用機制如出一轍， 網絡藥理學與中醫(yī)藥治療及辨證論治的觀點相符合[4]。

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi 干燥根，具有解肌退熱，生津止渴，升陽止瀉功效。 主要化學成分有異黃酮類、三萜類、黃酮類、香豆素類等,具有降糖降脂、抗炎抗氧化、保護肝臟等藥理作用[5]。 丹參為唇形科草本植物丹參Radix Salviae 干燥根和根莖，具有活血化瘀，涼血清心，除煩安神的功效。 主要化學成分包括丹參酮類、丹參酸類、揮發(fā)油等，具有抗氧化，抗炎、抗血栓等藥理作用[6]。 陳澈[7]從 369 篇中醫(yī)藥治療 T2DM 文獻中分析444 個中藥方劑， 對其涉及232 味中藥進行頻次分析，葛根、丹參分別占據(jù)了使用頻次表的第四及第五位，葛根-丹參藥對是中醫(yī)治療活血化瘀類糖尿病常用藥對。 本研究基于藥物多成分多靶點研究思路，通過網絡藥理學預測葛根-丹參藥對治療T2DM 的作用機制，分析篩選有效成分，活性靶點及疾病治療靶點和信號通路，為葛根-丹參藥對治療T2DM 實驗研究及臨床運用提供科學依據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 葛根-丹參藥對活性成分及潛在靶點的篩選借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺 （TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲取葛根、丹參的化學成分,根據(jù)生物利用度（OB）和類藥性（DL）篩選出符合條件的活性成分及相關靶點。

1.2 T2DM 相關靶點預測 通過 GeneCards（http://www.genecards.org/）數(shù)據(jù) 庫 ，以 “Type 2 Diabetes mellitus”為檢索詞，得到與T2DM 相關靶點，以相關性數(shù)值（Relevance score≥30）作為篩選條件，篩選結果作為T2DM 候選靶點基因。

1.3 中藥化學成分-作用靶點網絡構建 將篩選出來葛根候、丹參候選化合物和預測成分靶點基因導入Cytoscape3.7.1[8]軟件構建化合物-靶點網絡，根據(jù)網絡中的度值（Degree）分析葛根-丹參主要有效成分。

1.4 蛋白質相互網絡（PPI）的構建 藥物對疾病治療的效應最終表現(xiàn)在蛋白相互作用上。運用韋恩圖(Venn diagram)得到活性成分靶點與T2DM 靶點的交集基因，導入STRING11.0（http://www.string-db.org/），獲取蛋白相互作用關系。Cytoscape3.7.1 繪制相互作用網絡，degree 值分析關鍵靶點，構建葛根-丹參治療T2DM 作用靶點交互作用網絡。

1.5 葛根-丹參藥對治療T2DM 活性成分干預關鍵靶點分子對接預測 根據(jù)網絡藥理學結果分析，采用分子對接軟件預測葛根-丹參藥對主要活性成分干預關鍵靶點。 使用ChemOffice 軟件構建化合物 3D 結構， 并保存為.mol2 格式。 從 PDB（https://www.rcsb.org/） 數(shù)據(jù)庫下載靶點的蛋白結構，用PyMOL 對原PDB 蛋白分子進行蛋白與配體拆分，去氫，加水等操作，利用AutoDuck 軟件將上述化合物和蛋白格式轉換為PDBQT 格式。運用Autodock Vina 軟件進行化合物和核心靶點的分子對接，用PyMOL 對能量最低結合模式做圖。

1.6 葛根-丹參藥對治療T2DM 生物功能與通路富集分析 將葛根-丹參藥對治療T2DM 作用靶點導入ClueGO 插件，進行GO 富集分析和通路富集分析（P＜0.05），對潛在靶點進行生物過程（biological process），細胞組成(cellular component)，分子功能(molecular function)分析，KEGG 對潛在靶點進行通路富集分析。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選 通過TCMSP 查詢，葛根、丹參化學成分分別為 18 個、202 個， 經 OB≥30，DL≥0.18[9]篩選后，葛根、丹參化學成分分別為7個、61 個，葛根中的異黃酮類成分在葛根中的含量較高，雖然其OB、DL 值不符，考慮其藥理作用，結合文獻報道及臨床研究，仍然考慮將其列入后續(xù)研究。

2.2 化合物-靶點相互作用網絡 網絡圖直觀反映化合物和靶點間相互作用，節(jié)點代表化合物，邊代表了化合物和靶點之間關系。 黃色、粉色、藍色節(jié)點分別代表藥物靶點、葛根化合物、丹參化合物。化合物-靶標網絡包含了215 個節(jié)點和954 條邊，葛根-丹參藥對中每個化合物平均作用于15.9 個靶標，每個靶標平均與6.15 個化合物連接。因此可以體現(xiàn)出中藥單成分多靶點、 多成分多靶點及多成分相同靶點之間的協(xié)同疊加作用。 通過Cytoscape3.7.1 軟件繪制出化合物-靶點相互作用網絡圖，見圖1。

圖1 葛根- 丹參藥對化合物- 靶點相互網絡作用圖

度值排名前四的化合物分別為MOL000006-木犀草素(度值 54)、MOL012297-葛根素(度值 53)、MOL07154-丹參酮ⅡA (度值 40)、MOL000392-芒柄花黃素（度值32）。

2.3 葛根-丹參藥對與T2DM 的交集基因 通過數(shù)據(jù)庫分析，T2DM、葛根、丹參作用靶點分別為475個、94 個、117 個。 通過在線韋恩圖分析得出，葛根-丹參藥對活性成分作用靶點與T2DM 共有57個交集基因，葛根、丹參與T2DM 共有基因21 個(圖2)， 即為葛根-丹參治療 T2DM 的主要潛在靶點。

2.4 蛋白相互作用PPI 網絡構建 本研究基于STRING 數(shù)據(jù)庫分析葛根-丹參藥對治療T2DM 作用靶點之間的交互作用,通過在線韋恩圖得到化合物-疾病共有基因57 個導入STRING，交互作用可信度設置為最高值（0.900）構建靶點相互作用網絡（圖3），并進行網絡拓撲結構分析。 該網絡包括48個節(jié)點 （9 個靶點未發(fā)生蛋白互作關系），160 條邊。 在葛根-丹參藥對治療T2DM 蛋白質交互作用網絡中，度值前五的節(jié)點分別為：STAT3(24)、AKT1(21)、JUN(19)、MAPK1(15)，這四個關鍵靶點可能在葛根-丹參藥對治療T2DM 過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 葛根- 丹參作用靶點與T2DM 靶點交集基因韋恩圖

圖3 葛根、丹參與T2DM 蛋白相互作用網絡圖

2.5 葛根-丹參藥對治療T2DM 活性成分干預關鍵靶點的分子對接預測 網絡藥理學預測關鍵靶點為 STAT3(6UNQ)、AKT1(4EKL)、JUN(1JNM)、MAPK 1(3SA0)，使用AutoDock Vina[10]軟件對關鍵靶點與活性化合物葛根素、芒柄花黃素、木犀草素和丹參酮ⅡA 進行對接。一般認為配體與受體分子構象越穩(wěn)定，能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，以結合能≤-5kJ/mol 為篩選標準。 分子對接結果顯示STAT3 與葛根素 （-22.19）、AKT1 與丹參酮ⅡA 和木犀草素 （-34.75）、JUN 與丹參酮ⅡA（-26.80）、MAPK1 與丹參酮ⅡA（-35.17）具有最好結合力，將關鍵靶點與結合能最低的活性化合物進行分子對接，PyMoL 作圖，結果見圖4。

2.6 靶點通路分析 通過對關鍵靶標進行基因功能分析，得到 GO 分析（P＜0.05）生物過程 1483 個、分子功能 75 個、細胞組成 39 個（圖5）。 細胞組成主要涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、血小板α 顆粒等；分子功能主要為蛋白酶/磷酸酶結合、絲氨酸/蘇氨酸激酶調節(jié)活性、 生長因子/類固醇激素受體結合等功能上；生物過程主要涉及血管的生成、炎癥反應、細胞增殖、蛋白質代謝、神經保護作用。 血管生成方面： 正向調節(jié)血管平滑肌細胞增殖； 炎癥反應方面：氧化應激反應、細胞對活性氧反應；細胞增殖方面：上皮細胞增殖、肌肉細胞增殖、正向調節(jié)血管平滑肌細胞增殖；蛋白質代謝方面：對營養(yǎng)物質水平的反應； 神經保護作用： 對脂多糖刺激時反應。 基于這五個主要的方面分析，葛根-丹參藥對主要是通過多通路多靶點協(xié)同作用治療T2DM。

KEGG 結果分析， 共富集136 條信號通路，主要與PI3K-AKT 信號通路、 糖尿病并發(fā)癥的AGE/RAGE 信號通路、TNF-α 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、 流體剪切應力與動脈粥樣硬化等有著密切聯(lián)系。

3 討論

2 型糖尿病屬于中醫(yī)“消渴病”范疇，消渴病機為陰虛為本，燥熱為標，在糖尿病氣血津液盈虧過程中，血行不暢致瘀，淤血阻滯氣機，津液不布消渴加重，故糖尿病在診治過程中應注重活血化瘀，辨證論治。 葛根-丹參藥對臨床上用于表現(xiàn)有瘀血指征（舌質暗，或有瘀點，舌下靜脈瘀滯等）患者最宜，也適用于2 型糖尿病伴有心血管病變、視網膜病變、腎病等患者。

圖5 GO 和KEGG 富集分析圖

化合物-靶點研究結果顯示，60 個化合物對應155 個靶點,顯示藥物通過多成分多靶點治療疾病,最重要有效成分為葛根素、 芒柄花黃素、 木犀草素、丹參酮ⅡA。 研究表明，葛根素通過激活PI3K/AKT 信號通路，抑制胰島β 細胞凋亡，上調PPARγ mRNA 表達，促進 GLUT4 轉位至細胞膜[11,12]，增強葡萄糖向細胞內轉運， 調節(jié)細胞的糖脂代謝減輕IR。 此外，葛根素通過抑制 NF-κB、p38MAPK 信號通路，降低 TNF-α、IL-6、IL-1 等炎癥因子的表達，改善IR[13]，減輕炎癥反應有關。 芒柄花黃素可以降低血液中的甘油三酯（TG）含量，上調清道夫受體BI(SR-B，功能性的HDL 受體）蛋白含量,減輕外周組織膽固醇的蓄積, 進而調節(jié)體內血脂的代謝[14]。Na Xu 等[15]研究表明低劑量膳食補充劑木犀草素能降低小鼠附睪脂肪組織中肥大細胞的浸潤和炎性因子的水平，從而改善小鼠飲食性肥胖和IR；張雨點等[16]發(fā)現(xiàn)木犀草素是一種具有PPARγ 激動劑活性的新AMPK 激活劑，通過直接結合PPARγ，抑制 PPARγ Ser-273 位點磷酸化,升高 pAMPK（Thr-172）水平，抑制前體脂肪細胞分化和促進脂聯(lián)素高聚體化，有望成為治療T2DM 的潛在藥物。 臨床數(shù)據(jù)顯示丹參酮ⅡA 可以降低糖尿病患者的纖維蛋白原、血漿黏度、糾正血液流變異常,調節(jié)血脂[17]，起到保護糖尿病患者作用。 丹參酮ⅡA 磺酸鈉能逆轉SIRT1 蛋白低表白，抑制腎臟乙酰化Fox01蛋白表達,從而有效的改善糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂，延緩腎小球硬化，減少糖尿病腎病損害[18]。研究表明，葛根素聯(lián)合丹參酮ⅡA 可以降低血糖和血脂水平，降低糖尿病血管病變大鼠血清INS 及AGES含量,下調主動脈組織VCAM-1 蛋白表達,起到保護血管內皮作用[19]。葛根素和芒柄花黃素屬于葛根成分,木犀草素和丹參酮ⅡA 屬于丹參成分,這為葛根-丹參藥對治療T2DM 提供了理論和實踐依據(jù)。

通過葛根-丹參藥對治療T2DM 的物質基礎，構建其治療T2DM 的蛋白交互作用網絡。 本研究篩選出 STAT3、AKT1、JUN、MAPK1 在 T2DM 中發(fā)揮重要作用。 STAT3 是信號轉導與轉錄激活子3，STAT3 信號通路在外周和肝臟胰島素敏感性中起著重要的作用，研究表明[20]嚴重肥胖或T2DM 患者骨骼肌中STAT3 蛋白高度表達，降低STAT3 蛋白表達可以防止骨骼肌中脂質誘導胰島素抵抗的發(fā)展。 AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，STAT3作為激活AKT 的上游， 能夠對AKT 進行正向調控，促進AKT 的磷酸化及激活，調控葡萄糖和脂質代謝，激活AKT 途徑抑制脂解和肝糖原合成，改善IR[21]。 JUN 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）中的重要成員之一，JUN 是連接炎癥和胰島素抵抗的信號分子。 通過RNA 干擾技術敲除小鼠JUN 基因，可降低小鼠的血糖，并增強肝胰島素信號傳導；通過抑制JUN 信號通路,可以拮抗高糖誘導的心肌細胞凋亡[22]。MAPK1 也稱為細胞外信號調節(jié)激酶(ERK),主要參與細胞增殖分化、氧化應激等生理功能。 研究表明[23]抑制MAPK1/3 蛋白表達可以改善糖尿病大鼠心肌纖維化， 減弱高糖狀態(tài)下心肌組織的損傷。

通過對葛根-丹參藥對治療T2DM 生物功能與通路富集分析可知,與糖尿病相關的信號通路主要要：PI3K-AKT 信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE/RAGE 信號通路、TNF-α 信號通路、IL-17 信號通路等。 PI3K-AKT 信號通路已成為T2DM 重要靶點，PI3K 是一類催化肌醇與磷酯酰肌醇的脂質激酶，激活PI3KR1，生成細胞內重要信使，與AKT 結合,促進級聯(lián)反應。PI3K/AKT 信號通路介導GLUT4膜異位，激活GLUT4，調節(jié)血糖水平，PI3K/AKT 表達增加，激活eNOS 和PPAR，抑制NF-κB 的表達，調節(jié)血脂，減輕炎癥反應,抑制高糖對心肌細胞的損傷,保護血管[24]。 研究表明，IR 會使得 T2DM 患者產生認知障礙和代謝異常,葛根素可以激活PI3KAKT 信號通路，降低ROS 過度生成，恢復線粒體膜電位，增強細胞活性，減輕細胞凋亡，對膠質細胞起到神經保護作用[25]。AGE/RAGE 通路與T2DM 發(fā)生發(fā)展過程中有著一定的聯(lián)系， 晚期糖基化終末產物(AGEs)是糖尿病血管病變及功能損害的主要觸發(fā)因素，AGEs 與其受體RAGE 結合后可通過啟動一系列信號轉導，導致細胞因子的釋放，分泌大量的炎癥因子，加速血管內皮損傷，參與T2DM 并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中來[26]。 細胞內ROS 水平上升，使AGEs 上調RAGE mRNA 表達，降低內皮細胞一氧化氮合酶mRNA 水平和NO 的生物利用度， 促進炎癥因子釋放， 進一步加速了糖尿病視網膜病變中的血管損傷[27]。在高糖和血糖波動幅度增加的情況下，T2DM 患者血清 AGEs、RAGE 表達顯著性上調，使得血管內皮損傷加劇[28]。 TNF-α 是與肥胖相關的IR 和T2DM 發(fā)病機制的一個致病因子，主要是通過參與ROS 產生和各種轉錄介導途徑誘導脂肪和周圍組織炎癥反應， 在脂肪細胞中，TNF-α mRNA 水平與肥胖或高胰島素血癥程度呈正相關，介導IR, 加重患者病情, 但隨著體重降低脂肪中TNF-α 也隨之降低[29]。T2DM 被認為是一種自身免疫性炎癥疾病，IL-17 即可以介導炎癥也可以調節(jié)炎癥，IL-17 誘導促炎細胞因子（TNF-α）產生來介導免疫反應，參與動脈粥樣硬化、脂肪細胞的分化和IR 發(fā)病機制, 阻斷IL-17 表達可增強脂肪細胞分化標志物和脂聯(lián)素的表達[30]。 IL-17 家族包括I L-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E 和 IL-17F六種結構上相關的異構體，細胞因子IL-17A 最初被認為是慢性炎癥性疾病的介質， 但最近研究表明[31]IL-17A 調節(jié)腎組織氧化應激和AMP 蛋白激酶的活化，可以有利地調節(jié)炎癥，在晚期糖尿病腎病患者血漿和尿液中IL-17A 水平降低，表明小劑量IL-17A 是治療和逆轉糖尿病腎病的一種有前途的方法。

本研究采用網絡藥理學方法初步探討葛根-丹參藥對治療T2DM 機制。 從結果中可以看出葛根-丹參的主要有效成分可以通過STAT3、AKT1、JUN、MAPK1、等多個靶點參與，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、PI3K/AKT、TNF-α、IL-17 等相關信號通路的協(xié)同作用發(fā)揮療效，初步闡明了葛根-丹參藥對主要活性成分、作用靶點及信號通路在T2DM治療中的研究價值， 為基礎研究和實驗研究提供了理論依據(jù)和參考。 網絡藥理學篩選出的活性成分可能與T2DM 患者血液中實際吸收成分不一致，作用靶點的激活和抑制作用難以明確，研究靶點和信號通路會出現(xiàn)一定的偏差， 存在一定的局限性，因此為了提高結果的可靠性，還需進一步的開展后期實驗研究。