固定時間的動員方案與外周血造血干細胞分布規律分析＊

陳妙嬋，蔡葵，吳敏華，陳活強，劉棋楓

(廣東省佛山市第一人民醫院輸血科，佛山 528000)

異基因造血干細胞移植(allogeneic peripheral blood stem cell transplantation，allo- PBSCT)是指通過血細胞單采技術從供者體內獲取外周血造血干細胞來進行的移植[1]。 外周血干細胞采集的數量直接決定移植的成敗。 生理情況下供者外周血干細胞約占單個核細胞0.01%-0.1%, 難以滿足外周血干細胞移植的需求[2]。 CD34+細胞少于0.05,需要動員使CD34+細胞增加后通過血細胞分離造血干細胞,部分供者通過常規手段無法獲得足夠造血干細胞, 采集前白細胞計數與外周血干細胞數、CD34+細胞數有一定相關性， 表明外周血細胞計數可作為預測采集物CD34+細胞數量的良好指標[3-5]。 目前國內對供者外周血干細胞采集影響因素的研究報道多傾向于年齡、性別、注射重組人粒細胞集落刺激因子的劑量等， 而分析動員方案與外周血造血干細胞分布規律方面的文獻報道少見，本文通過回顧性分析固定時間的動員方案與非固定時間的動員方案干細胞產品的采集效率，探討動員方案外周血的 WBC、MNC、CD34+細胞的分布規律， 擬制定干細胞采集最佳時機的臨床路徑，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2016-2019 年在我院行異體PBSC（peripheral blood stem cell 造血干細胞）采集的健康供者 40 例, 其中男 21 例， 女 19 例； 年齡11-58 歲，中位年齡 31 歲；身高 152-178cm，中位身高167cm；體重54-89kg，中位體重66kg；所有健康供者均接受術前檢查：包括梅毒、艾滋、乙肝、丙肝等免疫學檢測指標正常，肝腎功能、生化電解質，凝血功能正常，無重要器官功能障礙，所有健康供者術前充分溝通知曉方案并簽儲知情同意書。

1.2 主要儀器 Baxter CS-3000plus（Baxter，美國），SysmexXE－2100 型血細胞分析儀，流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國）

1.3 PBSC 動員方案

1.3.1 方案1 固定時間的動員方案25 例，于單采前5 天開始給供者皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子( rhG-CSF)10μg/（kg·d），每 12 h 一次，采用8：00、20：00 各一次。

1.3.2 方案2 非固定時間的動員方案15 例，于單采前5 天開始給供者皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子( rhG-CSF)10μg/（kg·d），2 次/d，藥量同方案1，給藥時間2 次/d，早上、下午各注射一次。

1.4 PBSC 產品采集

1.4.1 方案1 健康供者動員第5 天用CS-3000血細胞分離機采集PBSC。 供者于動員后第4 天采多個時間點的外周血， 即 8：00、9：00、10：00、12：00、15：00、18：00，監測 25 例健康供者其外周血的血常規以及CD34+細胞比例。 取上述不同時間點的外周血檢測白細胞計數（WBC）、單個核細胞計數（MNC）與CD34+細胞數等數據繪制分布規律曲線圖。 根據第4 天繪制分布規律圖，第5 天取次高峰與高峰期在10:00-15:00 期間共300min 進行外周血干細胞采集，循環血量10000-15000ml（中位數為 12500），流速為 30-60ml/min，以 ACD 液為抗凝劑，取采集物少量稀釋后計算MNC 和CD34+細胞，計算供者產品的細胞總量。

1.4.2 方案2 健康供者按臨床現行上午、 下午各動員一次的慣例，于動員第5 天上午注射rhG-CSF 1h 后開始采集外周血干細胞共300min，循環血量10000-15000ml(中位數為12500),流速為30-60ml/min，以ACD 液為抗凝劑，取采集物少量稀釋后計算MNC 和CD34+細胞比例，計算供者產品的細胞總量。

1.4.3 根據干細胞不同動員方案采集有效率比較，制定臨床動員方案及采集最佳時機的臨床路徑。

1.5 統計學處理 采用SPSS19.0 軟件，計量資料經正態性檢驗后，用均數±標準差(±s)表示，兩組間計量資料比較采用獨立樣本t 檢驗，計數資料比較采用確切概率法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

40 例健康供者納入動員方案檢測范疇， 所有采集干細胞產品均進入結果分析。 固定時間的動員方案中25 例健康供者，動員后第4 天所取多個時間點的WBC、 外周血MNC、CD34+細胞比例的中位數等數據繪制趨勢曲線圖（圖1、2、3）。不同性別的健康供者PBSC 動員后干細胞的分布規律比較見表1，差異無統計學意義（P＞0.05）。 不同動員方案采集的供者干細胞數據比較見表2。不同動員方案采集有效率比較見表3。

圖1 固定時間的動員方案健康供者WBC 的分布規律

圖2 固定時間的動員方案健康供者外周血MNC 的分布規律

圖3 固定時間的動員方案健康供者CD34+比例的分布規律

表1 不同性別的健康供者PBSC 動員后干細胞數據比較(±s)

表1 不同性別的健康供者PBSC 動員后干細胞數據比較(±s)

性別 n 外周血單個核細胞（×109/L） 外周血CD34+（106/kg）男女P 21 19＞0.05 7.93±2.04 7.51±1.96＞0.05 6.32±1.94 5.98±1.52＞0.05

3 討論

表2 不同動員方案采集的供者干細胞數據比較(±s)

表2 不同動員方案采集的供者干細胞數據比較(±s)

動員方案 n 產品外周血單個核細胞（×109/L）產品CD34+（106/kg）方案一方案二產品MNC（108/kg）25 15 t P 7.02±2.04 4.21±1.05 4.06<0.01 7.02±2.17 2.28±1.05 6.47<0.01 4.68±1.94 0.70±0.52 6.31<0.01

表3 不同動員方案采集有效率比較

急性髓系白血病是起原于干、 祖細胞的造血系統惡性腫瘤，具有高度異質性，異基因造血干細胞移植是目前唯一可能治愈急性白血病的手段[6,7]。有效的動員既可以最大限度保障健康供者的利益，又能提高外周血單個核細胞的采集效率，把握最佳采集時機非常關鍵。 通常認為，外周血干細胞MNC 達(4-8)×108/kg 以上、CD34+細胞達(4-6)×106/kg 以上是用于異基因移植的最佳劑量[8]。本研究動員后PBSC 增長的高峰期通常在第4-6 天，在這期間采集干細胞產品就能獲得移植所需要的MNC和CD34+細胞,且在第5 天分離干細胞可以獲得最多的干細胞，最少量的T 細胞[9]。 以往臨床醫生在制定干細胞移植計劃時各有不同的動員方案及采集時機，存在一定的隨機性，不能保證最終采集效率， 本研究采用固定時間的動員方案rhG-CSF 10μg/（kg·d），每 12h 一次，并觀察動員后第 4 天的WBC、 外周血MNC、CD34+細胞比例的分布規律，從圖1、2 可看出WBC、外周血MNC 數量隨著注射時間的推移呈上升趨勢； 圖3 可見CD34+細胞比例在8:00 注射rhG-CSF1h 開始升高，4h 達到最高峰，5h 后呈下降趨勢，7h 后降至低水平，此時供者的WBC 與MNC 仍呈上升趨勢。 由此可得外周血MNC、CD34+細胞的變化程度不一， 但其變化趨勢有一定的規律， 當給健康供者采用固定時間注射rhG-CSF 時，其外周血干細胞的分布具有可預測的規律。 本研究采用固定時間的造血干細胞動員方案， 即供者皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子10μg/（kg·d），q12h（8：00、20：00 各一次），干細胞均在 12:00 達到峰值，10:00 至 15:00 為最佳采集時機。 通過分析固定時間的動員方案與干細胞分布規律的關系， 制定干細胞采集最佳時機的臨床路徑， 固定時間的動員方案與非固定時間的動員方案對比， 產品MNC 采集效率提高208%， 產品CD34+采集效率提高569%。

臨床上往往通過觀察健康供者外周血MNC或者CD34+細胞數量， 來指導供者的采集次數與所需循環血量。白雯等[10]采用動員方案為粒細胞集落刺激因子(G- CSF) 300μg/d 動員 3d ，產品MNC與采前供者外周血MNC 呈正相關, 產品CD34+細胞數與采前供者外周血MNC 呈正相關，提示采集干細胞產品前外周血中相對高的MNC 可使產品獲得較多 MNC 及 CD34+細胞。 從圖1、2、3 可見，自動員方案開始實行后，WBC 與外周血MNC 總體呈上升的趨勢，分布規律圖符合白雯等的報道，而CD34+細胞則在 8:00 注射 rhG-CSF 后 1h 開始升高， 4h 達到最高峰，5h 后呈下降趨勢。因此我們認為， 在指導選擇干細胞最佳采集時機方面， 觀察CD34+細胞比例的分布規律較外周血MNC 更為客觀。 方案一供者干細胞采集的最終產品量MNC 能一次性獲得達到最佳移植量， 超過80%產品CD34+能一次性獲得達到最佳移植量，可以滿足臨床干細胞移植所需， 而方案二均未能一次性獲得達到最佳移植量。

外周血干細胞移植的首要條件是造血干細胞有效動員和采集,并能較快持久地重建造血。 近年國內外不少單位已開展了此項工作， 但平均每例供者采集次數較多,且造血干細胞的采集效率高低差別較大[11]。PBSC 供者動員方案多樣，多是每天注射rhG-CSF 兩次，沒有明確規定間隔時間，無干細胞動員的規律依據[12,13]。 本課題所選擇的供者年齡范圍廣， 性別不同等因素均不會對動員后干細胞的分布規律有明顯的影響。 我們認為，固定時間的動員方案可獲得預期的干細胞分布規律， 從而可制定干細胞采集最佳時機的臨床路徑， 獲得較高的采集效率。 本研究所采用的供者皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)10μg /(kg·d），每12h 一次，即 8：00、20：00 各一次的動員方案，采集時機為9:00 至14:00，能一次獲得足夠治療量的造血干細胞，減少了采集所需要的時間和次數，極大的減輕了供者的痛苦與經濟負擔， 對外周血干細胞移植有著重要的指導意義。