氯硝柳胺和COS對紫貽貝的毒性作用機理

邵躍

摘?要：為研究氯硝柳胺和COS（一種樹根中提取物）對紫貽貝抗氧化酶活性的影響，通過毒性試驗的方法，測定紫貽貝組織的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、膽堿酯酶（CHE）的酶活性。結果表明，紫貽貝組織內SOD和MDA的變化趨勢是上升-下降， CAT和CEA的變化趨勢是下降-上升-下降的趨勢，由此可見，在兩種藥物脅迫下，紫貽貝機體雖沒有出現死亡表現，但其機體內的酶活性含量已發生了顯著的變化，可見這兩種藥物可能主要通過干擾紫貽貝機體應激機制來間接地造成氧化性損傷，最終導致紫貽貝死亡。通過對比兩種藥物對紫貽貝的四種生物標志物第10天的抑制率可知，氯硝柳胺對紫貽貝酶活性的敏感順序為：MDA>SOD>CHE>CAT，COS對紫貽貝酶活性的敏感順序為：CHE>SOD>CAT>MDA，可見紫貽貝組織中MDA和SOD酶對氯硝柳胺反應敏感，CHE和SOD酶對COS反應敏感。

關鍵詞：海洋污損生物;紫貽貝;氯硝柳胺;COS （一種樹根中提取物）;酶活性;毒性

海洋污損生物是海洋中附著在船底、浮標等人工設施上的一類生物，給人類的生產和生活帶來一定的危害。據統計，海洋污損生物約有2 000種，我國沿海約有200種，其中危害最大的有紫貽貝、牡蠣、藤壺等。為減少海洋污損生物給我們的生活和生產帶來的危害，擬通過實驗，研究出一種低毒高效的防污涂料。主要通過研究超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、膽堿酯酶（CHE）等生物標志物含量在受藥物脅迫的紫貽貝組織中的變化，探索氯硝柳胺和COS（一種樹根中提取物）對紫貽貝的毒性作用機理，從而為研究出一種低毒高效的新型防污涂料提供一個良好的依據。

1?實驗材料

紫貽貝：來自海鮮市場，個體大小盡量均等，洗凈暫養;實驗室常規儀器。

實驗藥品：氯硝柳胺（分析純，母液濃度為0.200 g/L）、COS（分析純，母液濃度為10.000 g/L）、考馬斯亮藍、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、膽堿酯酶（CHE）試劑盒、無水乙醇、冰乙酸等，以上藥品均購自生物公司。

海水經砂濾后抽取使用。溫度為（20±1）℃，pH值為7.9～8.1，鹽度為30‰。

2?實驗方法

2.1?暴露試驗

將洗干凈的紫貽貝放入裝有20 L海水的養殖箱中，每個養殖箱放入20個大小均等的紫貽貝，

分別投入8 mL的氯硝柳胺母液和100 mL的COS母液，曝氣，在兩種藥物中暴露2、4、6、8、10 d 時取樣，測定紫貽貝組織內SOD、CAT、CHE和MDA等酶活性含量。試驗時期不投喂。

2.2?組織勻漿的制備

將經藥物脅迫后的紫貽貝組織塊在0.86%冷生理鹽水中漂洗，再在濾紙上吸干水分，取0.2～1.0 g剪碎的組織塊，并加入其重量9倍的冷生理鹽水，在玻璃勻漿管中充分研磨十次（6～8 min），然后將制備好的組織勻漿用普通離心機3 000 r/min，離心10～15 min，制得10%組織勻漿，取上清液進行酶活性測定。

2.3?酶活性測定

組織酶蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、膽堿酯酶（CHE）的測定步驟按購自南京建成生物工程研究所的試劑盒的說明進行操作，所有指標的測定均設三個平行樣。

3?實驗結果與分析

3.1?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

在氯硝柳胺和COS脅迫下，2、4、6、8、10 d時紫貽貝組織內超氧化物歧化酶（SOD）活性變化見圖1、圖2。

圖1表明，紫貽貝在氯硝柳胺藥物脅迫下，其組織內SOD活性隨著藥物脅迫時間的延長，表現出先升高后下降的變化規律，至第6天的時候到達最大值，與空白對照組（SOD含量為11.02 U/mgprot）相比，紫貽貝組織內的SOD活性下降了15.8%。隨著藥物脅迫時間的延長，SOD的活性迅速下降，脅迫第10天的時候，紫貽貝組織內的SOD活性與空白對照組相比，抑制率為71.4%。

圖2表明，紫貽貝在COS藥物作用下，其組織內SOD活性隨著COS作用時間的延長，表現出先升高后下降的變化規律，脅迫期間紫貽貝組織內SOD活性都低于對照組。藥物在脅迫第6天的時候，SOD活性表現為一定的誘導作用，SOD活性升高，達到最大值，但與空白對照組相比，SOD活性下降了10.5%，隨著藥物脅迫時間的延長，SOD的活性呈下降趨勢，COS脅迫第10天的時候，與空白對照組相比，其抑制率為69.1%。

3.2?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內過氧化氫酶（CAT）活性的影響

在氯硝柳胺和COS脅迫下，2、4、6、8、10 d時紫貽貝組織內過氧化氫酶（CAT）活性變化見圖3、圖4。

由圖3可以看出，在氯硝柳胺脅迫的前6天，紫貽貝組織中CAT的酶活性逐漸降低，隨著藥物脅迫時間的繼續延長，CAT活性迅速升高，直到脅迫第8天時，再次達到最高點，與脅迫第2天時CAT活性相比，其值是脅迫第2天時CAT活性的90%，但隨著藥物脅迫的繼續延長，CAT活性迅速下降，達到最低值，為對照空白組（CAT含量為11.87 U/mgprot）相比，其抑制率為54.1%。

由圖4可以看出，在COS脅迫的前4天，紫貽貝組織中CAT的酶活性迅速降低，隨著藥物脅迫時間的繼續延長，CAT活性迅速升高，在脅迫第6天時，再次達到最高點，與脅迫第2天時CAT活性相比，其值是脅迫第2天時CAT活性的75%，隨著藥物脅迫的繼續延長，CAT活性迅速下降，與空白對照組相比，其抑制率為63.2%。

3.3?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內丙二醛（MDA）活性的影響

在氯硝柳胺和COS脅迫下，2、4、6、8、10 d時紫貽貝組織內丙二醛（MDA）活性變化見圖5、圖6。

MDA為膜脂過氧化產物，由圖5可知，紫貽貝組織中MDA含量的變化與SOD含量變化趨勢相對應，第6天達最高值，與空白對照組（MDA含量為10.38 nmol/mgprot）相比，其組織中MDA含量下降了53.4%。第6天后，MDA含量逐漸下降，脅迫第10天時，組織內的MDA含量，與對照組相比，其抑制率為78.4%，可能是此時膜已解體，細胞已趨死亡的原因。

由圖6可知，紫貽貝組織中MDA含量的變化與SOD含量變化趨勢相對應，其含量一直都低于空白對照組，在脅迫第6天時達最高值，脅迫第6天后，MDA含量開始下降，脅迫第10天時，組織內的MDA含量與空白對照組相比，其抑制率為43.4%。

3.4?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內膽堿酯酶（CHE）活性的影響

在氯硝柳胺和COS脅迫下，2、4、6、8、10 d時紫貽貝組織內膽堿酯酶（CHE）活性變化見圖7、圖8。

由圖7可知，在氯硝柳胺脅迫下，紫貽貝組織內CHE活性隨著藥物脅迫時間的延長，呈現出下降—上升—下降的趨勢。在藥物脅迫的前4天，CHE活性受到抑制，CHE活性迅速下降，之后隨著脅迫時間的延長，CHE活性又迅速上升，在第6天時再次達到最大，但CHE活性為脅迫第2天的77.5%，在脅迫第6天之后，CHE活性又迅速下降，脅迫第10天的時候，紫貽貝組織內的CHE活性與空白對照組（CHE含量為7.83 U/mgprot）相比，其抑制率為69.9%。

由圖8可知，在COS脅迫下，紫貽貝組織內CHE活性隨著藥物脅迫時間的延長，呈現出下降—上升—下降的趨勢。在藥物脅迫前4天，CHE活性受到抑制，CHE活性迅速下降，之后隨著脅迫時間的延長，CHE活性又迅速上升，在第6天時再次達到最大，但CHE活性為脅迫第2天的80.8%，在脅迫第6天之后，CHE活性又迅速下降，脅迫第10天的時候，紫貽貝組織內的CHE活性與空白對照相比，其抑制率為83.9%。

4?討論

4.1?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內SOD酶活性的影響

本研究發現兩種藥物脅迫紫貽貝后，其組織內的SOD活性都呈現出先上升后下降的趨勢，且兩種藥物脅迫下，SOD活性都低于對照空白組，由此表明在兩種藥物脅迫初期，機體出現一定的“毒物興奮效應”，即藥物在短時間內使紫貽貝組織內產生過量超氧陰離子自由基，為了使機體抗氧化防御系統免受損傷，紫貽貝組織內的SOD活性升高，而后隨著藥物脅迫時間的延長，紫貽貝體內產生大量的活性氧超過紫貽貝的SOD 清除能力時，便產生“毒物抑制效應”，對組織和細胞造成損傷，影響紫貽貝的正常生理活動，使SOD 活性降低和喪失[1]。與呂慶[2]的研究一致：當生物體受到輕度逆境脅迫時，SOD活性往往升高，而當受到重度逆境脅迫下，SOD活性通常降低，使生物體內積累過量的活性氧，從而導致生物體的傷害。因此，可以把機體中的SOD活性作為藥物對該機體抗氧化防御系統影響的一個指標。

4.2?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內CAT酶活性的影響

本實驗發現兩種藥物脅迫紫貽貝后，其組織內的CAT活性呈現出下降—上升—下降的趨勢，與吳益春[3]研究的在Cu2+脅迫下，櫛孔扇貝肌肉和內臟組中CAT活性變化趨勢相同。這是由于在藥物脅迫初期，水體中藥物在紫貽貝組織中蓄積及氧自由基的產生，同時機體體內SOD歧化反應，產生了大量的H2O2，破壞了紫貽貝機體的生理平衡，從而導致機體中CAT活性均有顯著的抑制作用，隨著藥物脅迫時間的繼續延長，機體的應激系統、抗氧化防御系統被全面激活，在H2O2的誘導下，CAT活性升高，以清除過量的氧自由基，使機體免受氧化傷害，從而表現為CAT酶活性迅速地升高。由于氧自由基反應速度非?？?，隨著藥物脅迫時間的繼續延長，有些未得到及時清除的氧自由基對細胞產生了不可逆的傷害，細胞結構受到一定程度的損傷，細胞的衰老加速，因此CAT酶活性又逐漸回落[3]，從而導致中毒反應發生，CAT酶活性再次下降，出現抑制作用。

4.3?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內MDA活性的影響

本實驗發現兩種藥物脅迫紫貽貝下，紫貽貝組織內MDA含量的變化與SOD含量變化趨勢相對應，呈現出先上升后下降的趨勢，這是由于藥物脅迫初期，機體產生大量的過氧化自由基，誘發機體中MDA含量升高，隨著藥物脅迫時間的延長，紫貽貝體內產生大量的過氧化自由基超過紫貽貝機體的清除能力，對組織和細胞造成損傷，影響紫貽貝的正常生理活動，使MDA含量降低。

4.4?氯硝柳胺和COS對紫貽貝組織內CHE酶活性的影響

本實驗發現兩種藥物脅迫紫貽貝后，其組織內的CHE活性呈現出下降—上升—下降的趨勢，由此表明：在藥物脅迫下，藥物能夠不可逆地與紫貽貝機體中的乙酰膽堿酯酶結合，從而抑制CHE的活性，導致機體內產生的乙酰膽堿不能及時分解，對機體的神經傳導造成了一定的影響，之后隨著藥物脅迫時間的延長，為了保護機體的中樞神經系統，機體內的應激系統被激活，大量的乙酰膽堿脂酶迅速分解機體積累的乙酰膽堿，隨后，乙酰膽堿脂酶活性受到抑制，紫貽貝體內積累大量的乙酰膽堿，從而使生物生理、生化過程失調和破壞，嚴重的甚至會導致生物死亡。在兩種藥物脅迫下，紫貽貝組織內的CHE活性變化范圍相同，均低于對照空白組，且變化幅度相似，說明兩種藥物對紫貽貝機體內CHE活性的影響程度相同。從實驗數值來看，兩種藥物對紫貽貝乙酰膽堿酯酶的抑制率較高，都達到60 %以上，因此，乙酰膽堿酯酶可被認為是較好的生物標志物。

5?結論

在低濃度的氯硝柳胺和COS脅迫下，紫貽貝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）和膽堿酯酶（CHE）變化趨勢相似，可知兩種藥物對紫貽貝的作用機理相似，同時隨著氯硝柳胺和COS脅迫時間的延長，紫貽貝組織內SOD和MDA呈現出先上升后下降的趨勢，CAT和CHE呈現出下降—上升—下降的趨勢。由此可見：在兩種藥物脅迫下，紫貽貝機體雖沒有出現死亡表現，但其機體內的酶活性含量已發生了顯著的變化，可見這兩種藥物可能主要通過干擾紫貽貝機體應激機制來間接地造成氧化性損傷，最終導致紫貽貝死亡。通過對比兩種藥物對紫貽貝的四種生物標志物第10天的抑制率可知，氯硝柳胺對紫貽貝酶活性的敏感順序為：MDA>SOD>CHE>CAT，COS對紫貽貝酶活性的敏感順序為：CHE>SOD>CAT>MDA，可見紫貽貝組織中MDA和SOD酶對氯硝柳胺反應敏感，CHE和SOD酶對COS反應敏感。因此，可以通過研究海洋污損生物—紫貽貝機體內SOD、CAT、MDA、CHE活性的含量變化，來評價防污涂料對海洋生態及海洋生物的影響程度，為研制開發無毒、高效的防海生物污染材料提供理論依據。

參考文獻：

[1] 江天久，曾淼，牛濤. 重金屬Cd2+脅迫對近江牡蠣超氧化物歧化酶活性的影響[J].熱帶海洋學報，2006，25（6）：63-67.

[2] 呂慶，鄭榮梁.干旱及活性氧引起小麥膜脂過氧化及脫酯化[J].中國科學（C輯），1996，26（1）：26-30.

[3] 吳益春，呂昕，王凡，等.Cu在扇貝組織中的蓄積及其對酶活性的影響[J].應用與環境生物學報，2005，11（5）：559-562.

（收稿日期：2020-08-19）