豨薟草提取物對膝骨關節炎大鼠軟骨組織損傷及NOX2/ROS/NF-κB通路的影響

董樺，李桂華，趙娜，杜書浩

天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193

膝骨關節炎(KOA)是中老年人群最常見的關節炎，其發病特點以關節軟骨退行性改變導致的關節軟骨損傷、破壞、關節軟骨邊緣和軟骨下骨反應性增生及骨贅形成為主[1]。目前KOA的西醫治療主要包括非甾體藥物抗炎鎮痛、腔內注射、關節鏡介入以及截骨術、關節置換術等。西醫治療起效快，但不容易兼顧“經濟簡便、長期有效”的治療目標。相比之下，傳統中醫藥治療骨關節炎在經濟療效綜合效益方面有一定的優勢[2]。豨薟草是治療關節骨痛的傳統中藥，具有補益肝腎、強筋壯骨之效，常用于治療痛風性關節炎、風濕性關節炎等。現代藥理研究表明，豨薟草中的有效化學成分二萜類、倍半萜類、黃酮類等，具有較好的抗氧化應激效果，具有抗炎、鎮痛作用[3，4]。NADPH氧化酶2(NOX2)/活性氧(ROS)/核因子κB(NF-κB)通路是氧化應激和炎癥反應相關的通路，在類風濕關節炎[5]、痛風性關節炎[6]等多種關節骨病中促進病情發展。目前關于豨薟草治療骨關節炎的報道較少。2019年8～11月，我們采用豨薟草提取物對KOA大鼠進行干預，觀察其對膝關節軟骨組織病理損傷的影響，并探討其與NOX2/ROS/NF-κB通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠75只，體質量210～230 g，(21±2)周齡，購于廣東省醫學實驗動物中心。鼠房飼養，環境溫度21～24 ℃，濕度50%～60%，循環照明模擬晝夜(12 h/12 h)，正常飼喂。

1.1.2 豨薟草提取物制備 豨薟草飲片購自廣州南北行中藥飲片有限公司。將飲片粉碎成粗粉，加入75%乙醇，反復加熱回流提取，過濾。將濾液稀釋10倍，減壓蒸餾獲得濃膏，再在冷凍干燥機冷阱中超低溫脫水，獲得棕黃色固形物。粉碎后取5 g溶于100 mL生理鹽水，配制成50 mg/mL的溶液。

1.1.3 試劑與儀器 骨組織番紅和固綠染色液(上海經科化學科技有限公司)；ROS指標丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(M-MLV)、BCA濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗NOX2多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。酶標儀(美國Molecular Devices公司)；倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，RT-PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 動物分組與模型制作 將大鼠隨機分為假手術組、模型組以及豨薟草低、中、高劑量組，每組15只。采用碘乙酸鈉誘導構建KOA模型[7]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，向雙側后肢膝關節腔注射50 μL碘乙酸鈉生理鹽水溶液，假手術組注射等體積生理鹽水。實驗第4、7、11、14天重復上述步驟。除注射碘乙酸鈉當天外，其余時間均進行轉輪鍛煉，轉輪速度設置為7 r/min，鍛煉時長30 min/d。實驗第18天結束鍛煉，完成建模。模型組大鼠膝關節解剖中觀察到膝關節內側間隙狹窄，關節平面粗糙且邊緣粗糙有骨贅生成，表明建模成功。

1.3 干預方法 造模成功后，豨薟草低、中、高劑量組分別給予75、150、300 mg/kg豨薟草提取物經口灌服，假手術組和模型組給予1.2 mL生理鹽水經口灌服，1次/d，連續3周。結束給藥24 h后，每組15只大鼠中隨機取6只用于組織學鑒定，其余9只用于MDA、SOD、NOX2、NF-κB檢測。

1.4 膝關節軟骨損傷評價 大鼠麻醉，沿體中線開胸，暴露心臟。將灌流針頭插入左心室，剪破右心房上端腔靜脈。打開灌流泵，先快速灌入150 mL生理鹽水，待心房流出清水樣液體后，慢速灌入4%多聚甲醛。取出后肢雙側膝關節，加入4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣處理4周。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將脛骨平臺外側軟骨下松骨質和股骨外側髁軟骨下松質骨沿下肢縱軸方向切片，切6 μm厚切片。將切片脫蠟至水，先滴加固綠染液處理3 min，蒸餾水沖洗；然后滴加媒染劑處理30 s，蒸餾水沖洗；最后滴加番紅染液處理1 min，蒸餾水沖洗。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，白光明場拍照。采用13分制，依據軟骨組織結構、細胞分布、組織著色程度及潮線情況進行Mankin分級評分[8]。

1.5 膝關節軟組織MDA含量和SOD活性檢測 MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸法，SOD活性檢測采用氮藍四唑法。大鼠斷頸處死，撥開雙側后肢皮膚，切下膝關節軟骨，放于EP管中低溫保存。取冷凍組織研磨成組織勻漿，取0.1 g勻漿加入檢測試劑盒中的提取液，冰浴混勻。4 ℃離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作。

1.6 膝關節組織NOX2、NF-κB mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取大鼠膝關節軟骨組織，使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度法測定總RNA含量，純度符合要求后，使用cDNA試劑盒逆轉錄合成cDNA。反應條件：37 ℃ 15 min，90 ℃ 5 s，4 ℃ 15 s。引物序列：NOX2上游引物5′-CCAGTGAAGATGTGTTCAGCT-3′，下游引物5′-GCACAGCCAGTAGAAGTAGAT-3′；NF-κB上游引物5′-TTGGATTTTCCACAGCCGTAG-3′，下游引物5′-AGAGTTACCTGGCCTGCAGG-3′；GAPDH上游引物5′-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3′，下游引物5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3′。以cDNA為模板進行擴增。擴增條件：90 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算NOX2、NF-κB mRNA的相對表達量。

1.7 膝關節組織NOX2、NF-κB蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測。向勻漿組織中加入蛋白提取液，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，用BCA試劑盒檢測總蛋白含量和純度。取蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉。分別加入一抗(稀釋比例：兔抗NOX2為1∶100，兔抗NF-κB和兔抗GAPDH均為1∶200)，0 ℃孵育過夜。加入二抗(稀釋比例為1∶100)室溫孵育30 min。使用增強的化學發光劑ECL顯色，凝膠成像儀曝光、拍照，Image Pro Plus6.0軟件分析電泳條帶，計算IOD值。以目的條帶與內參條帶IOD比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組膝關節Mankin評分比較 假手術組、模型組以及豨薟草低、中、高劑量組的Mankin評分分別為(0.83±0.47)、(10.32±0.87)、(7.62±0.92)、(5.85±1.09)、(3.06±0.65)分。與假手術組相比，模型組Mankin評分升高；與模型組相比，豨薟草各劑量組Mankin評分均降低，其中高劑量組低于中、低劑量組(P均<0.05)。

2.2 各組膝關節軟骨組織MDA含量和SOD活性比較 見表1。

表1 各組膝關節軟骨組織MDA含量和SOD活性比較

2.3 各組膝關節軟骨組織NOX2、NF-κB mRNA表達水平比較 見表2。

表2 各組膝關節組織NOX2、NF-κB mRNA表達水平比較

2.4 各組膝關節軟骨組織NOX2、NF-κB蛋白表達水平比較 見表3。

表3 各組膝關節組織NOX2、NF-κB蛋白表達水平比較

3 討論

KOA屬中醫學“痹癥”和“膝痹”范疇。傳統中醫認為，KOA發生的機制為“風寒濕合，經絡阻滯”，治療以活血化瘀、宣痹通絡為主[9]。豨薟草性味苦寒，歸肝、腎經，具有補益肝腎、強筋壯骨之效，能通經活絡、行痹止痛，與KOA證型相合。此外，豨薟草提取物中的生物活性成分二萜類、倍半萜類、黃酮類等具有鎮痛消炎、抗氧化應激的效果，可改善骨關節炎的相關癥狀[10]。本研究結果顯示，與模型組相比，豨薟草不同劑量組Mankin評分均降低，其中高劑量組低于中、低劑量組,表明豨薟草提取物能夠顯著改善膝骨關節炎大鼠的組織病理損傷，高劑量組效果更佳。

研究顯示，氧化應激可直接導致骨損傷和骨細胞凋亡，關節滑膜炎癥，影響軟骨細胞合成代謝，導致軟骨退化，是KOA病情發展的一個重要因素[11，12]。氧化應激是機體產生過量的自由基、ROS、活性氮，使內環境的氧化還原平衡被破壞的現象。ROS是氧化應激的主要產物，也是反映氧化應激程度的主要指標。活細胞中ROS可以通過二氯二甲基硅烷熒光染色直接測定，而在組織中ROS主要是通過氧化(如MDA)和抗氧化(如SOD)指標間接反映。其中MDA與ROS呈負相關，SOD與ROS呈正相關，因此推測MDA上升而SOD下降時ROS上升，反之亦然。ROS在炎性發生過程中發揮重要的作用，其可作為第二信使激活NF-κB等炎性信號通路上的關鍵因子，進而導致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的級聯反應。這些炎癥因子能激活未成熟的破骨細胞侵蝕骨質，干擾軟骨細胞代謝促使軟骨降解產生不可逆的纖維化，從而加重KOA[13]。本研究結果顯示，豨薟草不同劑量組MDA水平低于模型組，SOD水平高于模型組，且高劑量組的變化程度較中、低劑量組更明顯，表明豨薟草提取物能有效抑制大鼠膝關節組織的氧化應激反應，高劑量組效果更佳。

NOX2/ROS/NF-κB通路是氧化應激和炎癥反應相關的通路。NOX是ROS過量產生的關鍵跨膜蛋白，NOX2是NOX的典型代表，在巨噬細胞中表達豐富。機體靜息狀態下，除吞噬細胞中NOX2不會活化生成ROS外，其他細胞中NOX都有一定的活化，作為信號分子和基因開關維持細胞正常的增殖分化凋亡；在病原體、炎癥介質、機械損傷等作用下，細胞NOX大量轉錄激活，產生大量ROS，參與機體的宿主防御[14]。隨著KOA病情發展，滑膜和脂肪墊巨噬細胞隨之增多，加重膝骨關節損傷、滑膜炎和軟骨損傷。Sakurai等[15]報道，滑膜巨噬細胞通過增加炎性介質，加重對環氧合酶抑制劑耐藥的晚期關節炎的疼痛程度。Marlein等[16]報道，NOX2異常升高可促進骨髓脂肪和破骨細胞生成，參與有害的骨重塑過程。因此推測，抑制NOX2/ROS/NF-κB通路可能改善膝骨關節炎。本研究結果顯示，豨薟草不同劑量組NF-κB、NOX2 mRNA及蛋白水平均低于模型組，且隨劑量增大而降低；而SOD水平高于模型組，隨劑量增大而升高。由此可見，豨薟草提取物劑量能抑制NOX2/ROS/NF-κB通路激活，從而抑制大鼠膝關節組織的氧化應激及炎癥反應，減輕膝關節組織病理損傷，對膝骨關節炎具有顯著治療效果。