響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞甜菜堿超聲提取工藝

馮 蕾 林宇琪 林 雪 劉俊霞

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132101）

枸杞（Lycium barbarum）為茄科植物枸杞的成熟果實(shí)，是傳統(tǒng)藥食同源藥材[1]。枸杞子味甘、性平、歸肝、腎經(jīng)，有生精、補(bǔ)腎、保肝、明目、延緩衰老等功效[2]。這些藥用功效多與枸杞的抗氧化成分有關(guān)。甜菜堿是一種季銨型水溶性生物堿，是枸杞的主要活性物質(zhì)，具有降血壓、抗脂肪肝、抗腫瘤、抗癌、增強(qiáng)免疫力、增進(jìn)食欲等作用[3]。甜菜堿還具有促進(jìn)脂肪代謝、調(diào)節(jié)滲透壓、抗應(yīng)激等功效[4]，已作為一類新型飼料添加劑實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，被廣泛用于動物養(yǎng)殖業(yè)中。

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是近年來廣泛應(yīng)用的一種實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的方法，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型建立、模型驗(yàn)證等步驟。該方法通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及多元二次回歸方程擬合分析，同時借助直觀等高線圖和三維立體圖分析各變量之間的交互作用，最終實(shí)現(xiàn)各因素水平的最優(yōu)組合[5]。本文旨在采用超聲提取法提取枸杞中的甜菜堿，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對其工藝進(jìn)行優(yōu)化，使用分光光度法測其含量，旨在為枸杞中甜菜堿的綜合利用提供參考。

1 材料及儀器

1.1 材料 枸杞子購自當(dāng)?shù)厮幍辍Ｌ鸩藟A對照品（批號：894-20001）由成都曼思特生物有限公司生產(chǎn)。3%雷氏鹽溶液的配制過程：稱取水合雷納克酸銨0.75 g，加水25 mL，攪拌使溶解，過濾，備用（當(dāng)天配制）。

1.2 UV 5100型紫外 可見分光光度計(jì)由上海元析儀器有限公司生產(chǎn)，WGL-230B電熱鼓風(fēng)干燥箱由上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，AX324ZH電子天平由奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)，KQ-700V超聲波清洗器由昆山舒美超聲儀器有限公司生產(chǎn)，R1001-V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由鄭州長城工貿(mào)有限公司生產(chǎn)，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵由鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)。R509B恒溫浴鍋由上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，HH-4系列數(shù)顯恒溫水浴鍋由金壇市科析儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 枸杞的處理 將枸杞洗凈凍干后粉碎，過40目篩，放置于干燥器中備用。

2.2 枸杞甜菜堿的含量測定

2.2.1 制備溶液 ①對照品溶液的制備。取取甜菜堿對照品10 mg，放入 10 mL 的容量瓶，使用 0.1 mol/L 的鹽酸溶液定容，制得對照品溶液濃度為1.0 mg/mL，冷藏備用。②供試品溶液的配置。稱取枸杞粉末2.0 g，加入75%乙醇15 mL置具塞三角瓶中，提取時的超聲溫度為50℃，功率100 W，超聲提取30 min，提取兩次，合并濾液，濃縮后用蒸餾水定容于10 mL容量瓶中。

2.2.2 得到枸杞甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中，冰水水浴 10 min，分別加入2.5%的雷氏鹽溶液各6.0 mL，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，置冰浴中放置1 h，干燥濾紙濾過。沉淀后用70%的丙酮溶解，定容于10 mL容量瓶中。空白對照使用70%丙酮，在波長525 nm的情況下測定吸光度[6]，得到線性方程Y=1.057 8X+0.079 4，橫坐標(biāo)X為吸光度值，縱坐標(biāo)Y為濃度，相關(guān)系數(shù)r=0.997 2，表明枸杞甜菜堿在0.4～1.2 mg/mL的線性關(guān)系良好。

2.2.3 測定枸杞甜菜堿的含量 將使用上述方法得到的溶液轉(zhuǎn)移至燒杯并滴加濃鹽酸至pH=1，加入1 g活性炭粉末，加熱煮沸后放冷濾過。重新配置的雷氏鹽溶液濃度為1.5%，量取10 mL加入濾液中，攪拌均勻，轉(zhuǎn)移至25 m的L比色管中，加蒸餾水至刻度線。放入冰水中水浴3 h，沉淀析出濾過，用少量冰水沖洗沉淀，一并濾過。將沉淀轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入5～7 mL左右的70%丙酮，攪拌溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，再按上述方法測出吸光度值（A）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 甜菜堿供試品溶液1.0 mL，按照“2.2.3”中的操作方法測定6次，根據(jù)吸光度值計(jì)算RSD值。RSD值為0.65%，表明檢測儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性 取枸杞甜菜堿待測液溶液，分別測定供試品在0～180 min的吸光值，并記錄。RSD值為1.72%，表明供試品溶液在0～180 min內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.3.3 重復(fù)性 6份甜菜堿提取液，按照“2.2.3”的操作方法，使用紫外分光光度計(jì)在525 nm處測定枸杞甜菜堿的吸光度值，計(jì)算RSD值。RSD值為0.67%，表明本試驗(yàn)方法的重復(fù)性較好。

2.3.4 加樣回收率 取6份同一枸杞甜菜堿提取液標(biāo)好序號，分別加入1.0 mL對照品溶液，按照“2.2.3”的操作方法在紫外分光光度計(jì)525 nm處測定吸光度值，根據(jù)回收率計(jì)算出RSD值，如表1所示。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞甜菜堿超聲提取工藝 在超聲提取法單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度，液料比、提取時間3個因素，通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken的響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，具體試驗(yàn)因素與各水平值見表2、表3。

表1 加樣回收率分析表（n=5）

表2 枸杞甜菜堿提取試驗(yàn)Box-Benhnken結(jié)果數(shù)據(jù)表

表3 甜菜堿Box-Benhnken試驗(yàn)回歸模型方差分析表

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，在Design-Expert軟件中得到多元擬回歸二次方程：

F值（64.8）和P值（＜0.0001）表明所建模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。調(diào)整后的確定系數(shù)（Adj R2）和測定系數(shù)R2分別為0.97和0.988 1，與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合較好。變異系數(shù)（6.65%）也證實(shí)了模型的良好重現(xiàn)性。通過二階多項(xiàng)式模型的顯著性（P＜0.05），研究了乙醇濃度、液料比和提取時間3個自變量對甜菜堿提取率的影響。變量F和P的值越低，對響應(yīng)的影響就越大。從表2可以看出，乙醇濃度（A）和液料比（B）對響應(yīng)有極顯著影響（P＜0.01）；提取時間（C）對響應(yīng)有顯著影響（P＜0.05）。甜菜堿提取率的三維響應(yīng)面如圖1所示。

使用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化后的枸杞甜菜堿取率最高為1.6508%，提取時間為25.09 min，乙醇濃度為67.97%，液料比為7.86∶1。考慮到實(shí)際操作情況，得出最佳提取工藝為：超聲時間25 min，提取溫度70℃，料液比8∶1，乙醇濃度68%，提取2次。

2.5 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證 利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對超聲提取枸杞中甜菜堿工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化組合，確定最佳工藝條件為：超聲時間25 min，提取溫度70℃，料液比8∶1，乙醇濃度68%，提取2次。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，枸杞中甜菜堿得率的實(shí)際值為1.63%，預(yù)測值為1.615%，實(shí)際值與預(yù)測值基本相符條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際值與預(yù)測值基本相符。因此，該預(yù)測模型具有實(shí)用性和準(zhǔn)確性。

圖1 甜菜堿提取率的三維響應(yīng)面

3 結(jié)語

本試驗(yàn)采用超聲提取法和Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對枸杞中甜菜堿的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為從枸杞中提取甜菜堿提供了一種相對簡單、經(jīng)濟(jì)、高效的方法，可用于開發(fā)功能性食品和保健品。