常用色譜法對不同產地牡丹皮差異性研究*

孫露萍

(安徽省中西醫結合醫院，安徽 合肥 230031)

牡丹皮來源于毛茛科的植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的干燥去心根皮；苦、辛，微寒；歸心、肝、腎經；具有清熱涼血，活血化瘀的功效[1]。牡丹皮是在中醫臨床上應用比較廣泛的一種中藥，市場年需求量約在八千噸左右，六味地黃丸、活血散瘀湯等著名方劑的配方中均包含牡丹皮，其中含有鞣質類、單萜類等主要化學成分[2]。目前，牡丹皮藥材的主產地有安徽的亳州、銅陵與陜西商洛、山東菏澤等地，其中安徽的產量占總產量的50%左右。各相關記載與現代研究，皆首推銅陵鳳凰山一帶的“鳳丹”為最優，因此稱其為道地藥材，聞名于海內外[3-5]。牡丹皮的藥用部位的化合物的種類與含量均易受到種屬、氣候、種植環境等的影響，進而影響牡丹皮及其它相關產品的質量；現如今牡丹皮藥材的質控方法通常是將丹皮酚作為考察的依據和指標來定性或定量的，很顯然，這樣的做法既不具有專屬性，而且缺乏整體性。為加強牡丹皮的質量控制，用指紋圖譜技術研究牡丹皮藥材，對其質控方法與標準等的完善具有非常重要的意義。本文通過對不同產地牡丹皮薄層色譜法鑒別、HPLC法測定含量和指紋圖譜，來區分不同產地的牡丹皮，并通過結合兩種主要有效成分丹皮酚、芍藥苷的定量檢測，對不同產地的牡丹皮藥材的質量評估體系進行了完善和補充。

1 實驗材料

1.1 藥 材

多批次牡丹皮(采收地見表1)，經鑒定為毛茛科的植物牡丹的干燥去心根皮；牡丹皮的對照藥材(采購自中國食品藥品檢定研究院，批號：121490-201102)。

表1 牡丹皮采收地Table 1 Moutans Cortex harvesting areas

1.2 儀 器

Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SPDM-10Avp DAD檢測器，島津；LC-10ADvp泵，CTO-10AC柱溫箱，SIL-10A自動進樣器，SCL-10A控制器，LC Solution色譜工作站；AB135-S型電子天平，瑞士梅特勒。

1.3 試劑與耗材

色譜甲醇、乙腈，純化水，芍藥苷對照品(批號MUST-13113009，購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度99.97%)，丹皮酚對照品(批號MUST-16071405，購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度大于98%)；高效硅膠G薄層板，青島海洋公司。

2 不同產地牡丹皮薄層檢視

2.1 丹皮酚薄層色譜鑒定

取牡丹皮粉末各0.5 g，置于25 mL錐形瓶，加甲醇10 mL，稱量，密塞超聲20 min，用甲醇補足失重，作為供試品溶液。取丹皮酚適量，加甲醇制成0.50 mg·mL-1溶液為丹皮酚對照品。取對照品溶液與各樣品溶液各10 μL，分別點于同一塊硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯(2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵乙醇溶液，顯色。

圖1 丹皮酚薄層色譜鑒別 (從左到右依次為丹皮酚對照品、1、2、4、5、7、9)Fig.1 TLC identification of Paeonol (from left to right: paeonol reference substance, 1, 2, 4, 5, 7, 9)

2.2 芍藥苷薄層色譜鑒定

圖2 芍藥苷薄層色譜鑒別Fig.2 TLC identification of Paeoniflorin

取牡丹皮粉末0.5 g，置于25 mL錐形瓶，甲醇10 mL，稱量，密塞超聲20 min，用甲醇補足失重，作為供試品溶液。取芍藥苷適量，加甲醇制成0.50 mg·mL-1溶液為芍藥苷對照品。取對照品溶液與各樣品溶液各10 μL，分別點于同一塊硅膠G板上，以氯仿:乙酸乙酯:甲醇:甲酸(40:5:10:0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

2.3 薄層檢視總結

經薄層鑒別，不同產地牡丹皮均含有芍藥苷和丹皮酚，期望通過薄層方法對不同產地牡丹皮進行區分難度較大，而薄層檢視長處在于定性鑒別，方法簡單快捷，適用于快速檢查，為更好的區分不同產地牡丹皮，因此對不同牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚進行含量測定。

3 牡丹皮芍藥苷與丹皮酚的含量測定[6-9]

3.1 色譜條件

色譜柱：選用Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%甲酸溶液的水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0～15 min(10%B～20%B)，15～27 min(20%B)，27～40 min(20%B～30%B)，40～60 min(30%～50%B)；檢測波長：選取230 nm和274 nm(中國藥典所規定的芍藥苷與丹皮酚的檢測波長)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。

3.2 對照品溶液的制備

分別取2.36 mg芍藥苷標準品與3.99 mg丹皮酚標準品，置于10 mL的容量瓶中，加入色譜甲醇定容到容量瓶的刻度線，即可得到本次實驗所需的混合對照品(芍藥苷與丹皮酚)溶液。混合對照色譜圖如圖3所示。

圖3 混合對照色譜圖Fig.3 Mixed standers chromatogram

3.3 供試品溶液的制備

精密稱定0.5 g的各樣品粗粉，分別置于具塞錐形瓶中；再精確添加50 mL色譜甲醇，密塞，稱定重量；超聲處理30 min后，取出，待冷卻，再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量；搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即可得到本次實驗所需的供試品溶液。

3.4 線性關系考察

精密稱定芍藥苷3.13 mg、丹皮酚5.28 mg，根據2.2項下所述配制方法來配制，然后用移液管吸取5 mL第一份樣品溶液置于另一10 mL容量瓶，再用色譜甲醇溶液定容到容量瓶的刻度線，搖晃均勻后，即得第二份樣品。第三份樣品取第二份樣品溶液5 mL，定容，以此類推，共制成七份對照品標準溶液。每次進樣10 μL檢測，記錄并分析HPLC色譜圖，以所測得的色譜峰峰面積A作為線性回歸的Y坐標，樣品的濃度(μg/mL)作為線性回歸的X坐標進行回歸計算，得芍藥苷的線性回歸方程為Y=11267X-35242，r=0.9991(n=7)，丹皮酚的線性回歸方程為Y=44643X+65589，r=0.9999(n=7)。由結果可知芍藥苷和丹皮酚兩者分別在4.89～313 μg/mL與8.25～528 μg/mL濃度范圍內，丹皮酚與芍藥苷的色譜峰峰面積與其濃度之間有著較好的線性關系。

3.5 精密度實驗

精密稱定0.5 g樣品粗粉，依照3.3項下所述的配制溶液的方法來配制，每次進樣10 μL所配制的供試品溶液，依照3.1項所述條件下連續進樣5次檢測，以進樣檢測的芍藥苷和丹皮酚的色譜峰峰面積計算，兩種化學成分的相對標準偏差(RSD)分別為 2.93%、1.96%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復性實驗

精密稱定同一批樣品的(根皮)粗粉共5份，每份0.5 g，依照3.3項下所述配制方法來配制，各樣品溶液分別進樣10 μL，根據3.1項下所述的條件分別進樣檢測，以進樣檢測的的含量來計算，芍藥苷和丹皮酚兩者的相對標準偏差(RSD)分別為1.93%和1.77%，表明該方法重復性良好。

3.7 穩定性實驗

精密稱定0.5 g樣品(根皮)粗粉，依照3.3項下所述的配制溶液的方法來配制，每次進樣10 μL樣品溶液，根據上述的色譜條件先后在0、2、4、6、8、12 h進樣檢測，以測定的芍藥苷和丹皮酚色譜峰的峰面積計算，得到芍藥苷與丹皮酚的相對標準偏差(RSD)分別為1.91%、2.31%(如表4所示)，說明供試品溶液在12 h內較穩定。

3.8 加樣回收率實驗

精密稱定樣品(根皮)粗粉共6份，每份0.25 g，每份樣品中加入一定量的芍藥苷和丹皮酚標準照品，根據3.3項下所述的配制溶液的方法，配制供試溶液，每份進樣10 μL檢測，記錄并分析HPLC色譜，分別計算芍藥苷與丹皮酚的回收率(詳見表5、表6)，得到芍藥苷與丹皮酚二者的平均回收率分別為98.05%、98.72%，芍藥苷與丹皮酚二者的相對標準偏差(RSD)均小于5%(如表2、表3所示)，表明回收率符合該實驗研究的規定。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(n=6)Table 2 Paeoniflorin sample recovery test (n=6)

表3 丹皮酚加樣回收試驗(n=6)Table 3 Paeonol sample recovery test (n=6)

3.9 樣品測定與數據分析

按3.1項下色譜條件，對上述各供試品與對照品溶液進行測定，每次進樣10 μL，經計算，得到不同產地中丹皮酚和芍藥苷的含量，質量分數平均值結果見表4。

表4 各樣品中芍藥苷與丹皮酚的質量分數Table 4 The mass fraction of paeoniflorin and paeonol in each sample

利用SPSS數據處理軟件，對10批樣品測得的芍藥苷與丹皮酚的含量數據進行方差分析，以顯示產地與含量之間的關系，結果表明不同產地牡丹皮芍藥苷與丹皮酚的含量有顯著性差異。

4 牡丹皮HPLC指紋圖譜研究[10-13]

4.1 色譜條件

同2.1。

4.2 對照品溶液的制備

同2.2。

4.3 供試品溶液的制備

同2.3。

4.4 精密度試驗

精密稱定0.5 g的樣品(根皮)粗粉，根據3.3項下配制的方法來配制，每次進樣10 μL所配制的樣品溶液，依照3.1項所述的實驗條件連續進樣5次檢測。因2號峰(芍藥苷峰)出峰時間適中，峰面積大，所以選擇2號峰為參照峰，計算其余5個峰的相對峰面積，并計算RSD的值。結果顯示，它們的相對標準偏差(RSD)分別為0.70%、0.00%、1.72%、2.90%、1.01%、0.54%、2.92%、1.62%、0.45%、0.61%，均小于3%，表明儀器精密度較好。

4.5 重復性實驗

精密稱定同一批樣品的(根皮)粗粉共五份，每份0.5 g，根據3.3項下溶液配制的方法來配制，每次進樣10 μL的各樣品溶液，根據3.1項所述的條件分別進行檢測。因2號峰(芍藥苷峰)出峰時間適中，峰面積大，所以選擇2號峰為參照峰，計算其余5個峰的相對峰面積，并計算RSD的值。結果顯示，它們的相對標準偏差(RSD)為0.53%、0.00%、1.48%、2.07%、1.21%、1.80%均小于3%，說明方法的重復性良好。

4.6 穩定性實驗

精密稱定0.5 g的樣品(根皮)粗粉，根據3.3項下的溶液配制方法來配制，每次進樣10 μL的樣品溶液，按照3.1項下所述的條件先后在0、2、4、6、8、12小時進樣檢測。因2號峰(芍藥苷峰)出峰時間適中，峰面積大，所以選擇2號峰為參照峰，計算其余5個峰的相對峰面積，并計算RSD的值。結果顯示，它們的相對標準偏差(RSD) 為2.04%、0.00%、0.61%、2.80%、1.13%、1.01%、4.24%、3.03%、1.03%、0.55%，均小于3%，說明供試品溶液在12 h內較穩定。

4.7 樣品的HPLC指紋圖譜的測定

根據3.3項下供試品溶液配制方法，首先依法配制好各樣品溶液，然后分別進樣，每次10 μL，根據3.1項下的實驗條件進樣檢測，記錄分析各樣品60 min的HPLC色譜圖。結果如圖4所示。

圖4 不同產地牡丹皮根皮樣品指紋圖譜與對照藥材疊加圖Fig.4 The fingerprint of Moutans Cortex samples from different places and the superposition of the control medicinal materials

4.8 樣品的HPLC指紋圖譜相似度分析

表5 不同產地樣品HPLC與對照藥材圖譜相似度比較Table 5 Comparison of similarity of HPLC and control medicinal materials of samples from different origins

利用國家藥典委員會發布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件，將AIA格式的HPLC色譜圖文件依次導入軟件，將相同產地的色譜圖通過指紋圖譜軟件先進行合成，擬合產地指紋圖譜，再將各產地指紋圖譜進行比較。結果如表5所示，不同產地的牡丹皮藥材相似度為0.912～0.985，安徽銅陵產牡丹皮指紋圖譜與對照藥材的指紋圖譜的相似度最高，各產地間指紋圖譜相似度存在差異，表明指紋圖譜可用來對不同產地間牡丹皮進行比較。

5 結論與討論

5.1 檢測波長的選定

實驗在用HPLC法對不同產地牡丹皮進行指紋圖譜的研究時，利用DAD全波長掃描檢測，在190～400 nm的色譜圖中，參考丹皮酚的檢測波長，選定274 nm作為本次實驗研究的檢測波長時，HPLC顯示的色譜峰較少；參考芍藥苷的檢測波長，選取藥典所規定的芍藥苷檢測波長230 nm作為指紋圖譜的檢測波長時，色譜圖基線漂移明顯；選取248 nm為檢測波長時，所顯示的HPLC色譜圖基線平穩、峰的數目較多，并且峰的峰形與分離度都較好，能夠實現較為理想的分離效果，故此選擇248 nm作為檢測波長對牡丹皮及其它樣品HPLC 指紋圖譜研究。

5.2 含量測定與指紋圖譜相似度分析結果討論

化學成分含量的比較往往是鑒定、區分中藥好壞的重要指標之一，但單純的比較單個成分的多少進行產地區分，缺乏整體觀念，而指紋圖譜法有著信息量大，“整體性”和“模糊性”為顯著特點，因此通過不同產地指紋圖譜進行比較可以對不同產地藥材進行區分。本文采用含量測定與指紋圖測定同時進行的方法，在保證區分度的前提下，相較于單獨進行含測和指紋圖譜分析，減少分析所需時長，與一測多評相符合，可作為牡丹皮質量評價的補充。