熒光假單胞桿菌磷脂酶B界面催化分子機制初探

趙依威，姜芳燕，李春，戴大章

（北京理工大學化學與化工學院，北京100081）

引 言

磷脂酶（phospholipase, PL）是催化磷脂水解的一類酶的總稱，廣泛應用于油脂精煉、磷脂改性與生物醫藥等領域[1]。根據PL作用位點的不同可分為PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLD（圖1）。PLA1是專一水解天然磷脂Sn?1 位酰基的酶，可以得到Sn?2 酰基溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿；PLA2專一催化水解磷脂Sn?2 位酰基，生成溶血磷脂和脂肪酸；PLC作用于磷脂酰膽堿，生成甘油二酯和磷脂膽堿；PLD 水解磷脂酰膽堿生成磷脂酸和膽堿，而PLB 則能同時水解磷脂Sn?1 位和Sn?2 位酰基，具有酯水解酶和溶血磷脂酶?轉酰基酶的活性。PL是一類界面酶，在異相系統(油、水界面)中具有較高的催化活性，具有界面激活（interfacial activation）現象[2]。

圖1 PL作用于磷脂分子位點示意圖（X代表氫、膽堿、乙醇胺、絲氨酸、肌醇等）Fig.1 The diagram of phospholipases acting on sites of the phosphatidylcholine

本課題組從油脂廠附近土壤中篩選到一株PLB高產菌株Pseudomonas fluorescens BIT?18[3]，該菌株能產生高活性PLB（Pf?PLB），首次克隆到Pf?PLB 基因（GenBank登錄號：HQ401021.1），構建了表達載體pET?28a(+)?pfplb，并將其成功轉入宿主細胞E. coli BL21(DE3)中，實現了Pf?PLB 的誘導型表達[4]。利用自行構建的工程菌株發酵生產的rPf?PLB 對大豆毛油進行脫膠時，豆油磷含量由234 mg/kg 下降至4.1 mg/kg，達到了植物油精煉的國家標準（10 mg/kg）和歐州標準（5 mg/kg），顯示了良好的應用前景。為進一步優化工藝參數和拓展其應用范圍，本文將對Pf?PLB 界面催化的分子機制進行探討，旨在為PLB的理性改造及其工業化推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

Pseudomonas fluorescens BIT?18 磷 脂 酶B（Pf?PLB），本實驗室發酵生產。大豆磷脂，北京美亞斯磷脂技術有限公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.2 軟件

多重序列比對軟件ClustalX 2.0 和DNAMAN 10.0；蛋白質結構模擬軟件Modeller 9.18；蛋白質結構顯示工具Swiss Pdb?Viewer 4.1等。

1.3 主要分子操作及酶分離純化

細菌總DNA 提取、回收DNA、感受態細胞的制備、連接產物轉化、質粒提取、突變體構建等操作參照文獻[5]進行。

1.4 氨基酸序列理化性質分析

參考文獻[6]的方法，采用瑞士生物信息研究所開發的ExPASy（Expert Protein Analysis System）中的ProtParam 分析Pf?PLB 的氨基酸組成、分子量、等電點（pI）等基本理化特性。

1.5 序列同源性分析

將Pf?PLB 氨基酸序列提交NCBI 數據庫，進行BLASTP 比對，搜索同源蛋白序列；將所測序列通過BLASTN 與NCBI 數據庫序列進行比對，查找相似核酸序列，利用軟件ClustalX 2.0 和MEGA 4.0 構建系統進化樹。

1.6 Pf-PLB蛋白結構預測

采用PredictProtein[7]和SOMPA[8]分析Pf?PLB 的二級結構；采用Modeller 9.18[9]同源建模預測Pf?PLB的三級結構。

2 結果與討論

2.1 Pf-PLB氨基酸序列理化性質分析

基于Pf?PLB 一級序列，借助于ExPASy 軟件中的ProtParam 與ProtScale 模塊對Pf?PLB 的理化性質進行了分析。ProtParam 分析結果表明，Pf?PLB 的GRAVY（grand average of hydropathicity）值為?0.298，說明Pf?PLB 為親水蛋白（在2 與?2 之間，正值表明此蛋白為疏水蛋白，負值表明為親水蛋白）；ProtScale 分析結果表明，Pf?PLB 的N 末端含有較多的疏水性殘基，而C 末端氨基酸序列則表現為較明顯的親水性（圖2）。

圖2 ProtScale對Pf?PLB的疏水性的分析（正值為疏水，負值為親水）Fig.2 Analysis of the hydropathicity of Pf?PLB by ProtScale

一般來說，蛋白質親水區多位于分子表面，這種結構有利于維持其在水溶液中的穩定性。若某區域疏水性較強卻位于分子表面，則會影響其在水溶液中的穩定性。例如P.aeruginosa 脂肪酶的N 端具有強疏水性且位于分子表面，因此該蛋白在水溶液中容易通過疏水作用發生聚集或吸附[10]。因此，根據ProtParam 和ProtScale 分析結果，結合其在溶液中的穩定性特征，初步判斷Pf?PLB 的親水性C 端位于酶蛋白分子表面，疏水性N端位于內部，而酶蛋白分子總體上表現為親水性。

2.2 Pf-PLB蛋白質二級結構分析

蛋白質二級結構的預測大多以已知三維結構和二級結構的蛋白質為依據。因此，根據Pf?PLB 的氨基酸序列，采用SOMPA 來分析Pf?PLB 的二級結構（圖3）。結果表明，在Pf?PLB 蛋白質二級結構中，含有較高比例的無規卷曲（54.14%），其余為β?折疊片層（24.59%）和α?螺旋（17.97%），此外還有少量的β?轉角（3.31%）。此外，PredictProtein 預測Pf?PLB 為球狀蛋白，其序列中不含半胱氨酸，因此不形成二硫鍵。

2.3 Pf-PLB界面催化機制分析

Pf?PLB 是一類能夠降解磷脂的酯酶，在異相系統(油、水界面)中具有較高的催化活性。此類酶大多具有一個共同特點，即具有“艙蓋(hatch)”結構域，其覆蓋在活性位點，阻止底物“非請自入”[11]。經同源建模分析，Pf?PLB 結構與P.aeruginosa FadL 蛋白結構、E.coli FadL蛋白結構之間有以下共性特征（圖4）：整體結構為14 個Strand 組成的β?桶；Loop 3 和Loop 4在β?桶上側，形成類似蓋子（lid）結構域；第3個Strand 形成扭結（kink）結構，從而使β?桶側面有一個側向開口；三個α?螺旋形成hatch 結構域，作為β?桶的桶底。

圖3 SOMPA對Pf?PLB進行二級結構預測Fig.3 Prediction of secondary structure of Pf?PLB by SOMPA

圖4 Pf?PLB與來源于E.coli和P.aeruginosa的FadL結構比較Fig.4 Structure comparison between Pf?PLB and FadL from E.coli and P.aeruginosa

圖5 Pf?PLB界面催化的可能機制Fig.5 Possible mechanism of Pf?PLB interfacial catalysis

基于Pf?PLB 結構特征，參考Berg 等[12]和Hearn等[13]在Science 和Nature 上對Pf?PLB 同源結構FadL的描述，本文提出“掀蓋進入，側向離去”假說模型（圖5），以闡述Pf?PLB 界面催化的可能機制。模型假定Pf?PLB 催化底物磷脂的過程主要有以下幾個步驟：①受Pf?PLB 分子的低親和力結合位點吸引，界面上的底物磷脂逐漸靠近β?桶；②當底物磷脂接近β?桶時，Loop 3 和Loop 4 發生結構調整，敞開蓋子結構域（lid）便于底物進入β?桶，即“掀蓋進入”；③底物進入β?桶后，依次與低親和力結合位點、高親和力結合位點結合；④底物磷脂在Pf?PLB 活性中心催化基團作用下，水解生成磷酸甘油酸和游離脂肪酸，同時Pf?PLB 的N 端結構域的結構發生調整，以便產物從第3 個Strand 的扭結（kink）結構側口離開β?桶，即“側向離去”。

為驗證上述機制，采用定點突變方法將Pf?PLB第3個Strand 上126位苯丙氨酸L（CTC）突變為精氨酸R（CGA），同時將第2 個Strand 上103 位纈氨酸V（GTA）突變為谷氨酸E（GAA），將雙重突變Pf?PLB的催化特性與單重突變和未突變Pf?PLB 進行比較分析。由于精氨酸和谷氨酸分別帶有正電荷和負電荷，因此可形成鹽橋，形成的鹽橋可關閉S3 和S2之間的側向開口，造成產物的釋放障礙，使Pf?PLB催化活性大幅降低（圖6）。

結果表明，V103E 突變體Pf?PLB 和L126R 突變體Pf?PLB 的活性分別是未突變Pf?PLB 的83.9%和74.2%，而V103E/L126R 雙重突變體Pf?PLB 的活性則僅為未突變Pf?PLB的7%。同時，Modeller分子模擬結果顯示，未突變Pf?PLB[圖7（a）]在S2 和S3 之間有明顯的側向開口，而突變Pf?PLB（V103E/L126R）[圖7（b）]則沒有側向開口。這些結果較好地佐證了本文提出的“掀蓋進入，側向離去”假說機制：V103E/L126R 雙重突變體Pf?PLB 的103 位谷氨酸和126位精氨酸間形成了鹽橋，關閉了S3和S2之間的側向開口，從而阻止了產物從β?桶的側向開口離去，導致產物在β?桶內大量積聚而形成產物抑制，因此V103E/L126R雙重突變體Pf?PLB 的催化活性大幅降低。

圖6 不同菌株所產Pf?PLB活性分析Fig.6 Activity analysis of Pf?PLB from different strains

圖7 Pf?PLB的Modeller模擬Fig.7 Modeller simulation of Pf?PLB

3 結 論

采用同源建模的方法研究了Pf?PLB 的三維空間結構，并基于其結構特征，在分子水平上了提出了“掀蓋進入，側向離去”假說模型，闡述了Pf?PLB界面催化的可能機制，并采用定點突變對Pf?PLB 的結構進行了改造，分別考察突變體Pf?PLB 與單重突變和未突變Pf?PLB 的催化特性，從而對所提出的機制模型進行了驗證。結果表明，雙重突變體Pf?PLB的103 位谷氨酸和126 位精氨酸間形成的鹽橋關閉了β?桶的側向開口，造成產物釋放障礙，引起產物在β?桶內大量積聚而形成產物抑制，致使其催化活性大幅降低。磷脂酶B 界面催化分子機制的研究，對酶分子結構理性改造及其工業化推廣應用具有重要的指導意義。