高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法快速篩查保健食品中10種雄性激素類非法添加物

張虹艷,邱國玉,石曉峰，2*，王行智，王小喬，許曉輝,李晨曦,潘秀麗

(1.蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省醫學科學研究院，甘肅 蘭州 730050)

保健食品，是指具有特定保健功能或能補充維生素、礦物質的食品，適宜于特定人群食用，不以治療疾病為目的，不對人體產生任何急性、亞急性或慢性危害[1]。不法商販為了達到其宣稱的保健功效，而在保健食品中非法添加化學藥物，不可避免地會危害人體健康。近年來出現了許多增強體力、改善生長發育類的保健食品，除了添加以西地那非為代表的磷酸二酯酶5抑制劑以外，添加雄性激素類藥物的情況也時有發生。雄性激素主要指由性腺(睪丸)合成的一類內分泌激素,消費者在不知情的情況下長期不合理地攝入雄性激素會引起內分泌失調、新陳代謝紊亂，以及增加罹患癌癥的風險[2-3]。

目前我國發布的相關檢驗標準多為補充檢驗方法，檢測對象包括改善睡眠類、降血糖類、降血脂類、降血壓類、減肥類、緩解體力疲勞類等非法添加物，有關雄性激素類非法添加物的檢測鮮有報道，且缺乏保健食品中雄性激素類非法添加物的檢測標準。國內外報道的食品中性激素類非食用添加物的檢測方法主要有氣相色譜-三重四極桿質譜法[4-5]、液相色譜-三重四極桿質譜法[6-13]、高效液相色譜法[14-16]，但上述方法均存在分辨率低、驗證手段少和定性分析不準確的問題。高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(HPLC-Q-TOF MS)法可對化合物的結構和裂解規律加以確證,大幅提高定性篩查能力，動態擴充篩查范圍，提前發現潛在風險，被國內外廣泛應用于非法添加物檢測領域。

本研究基于高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法，建立了固體基質、液體基質和油性基質保健食品中10種雄性激素類非法添加物的快速篩查技術，可為完善國家標準提供依據,同時為打擊保健食品行業非法添加行為、規范保健食品市場提供有力的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6545高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀(美國安捷倫公司)；5810R冷凍離心機(德國艾本德公司)；VORTEX KB-3渦旋振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；MS105DU電子天平(美國梅特勒公司)，Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)。

標準品：丙酸諾龍(純度98.6%，下同)、諾龍(96.7%)、去氫睪酮(98.8%)、氟甲睪酮(98.0%)、表睪酮(98.0%)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲睪酮(99.5%)、美雄諾龍(99.9%)、苯丙酸諾龍(99.1%)、丙酸睪酮(99.8%)、睪酮(96.6%)購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、正己烷(色譜純，默克公司)。固體基質、液體基質和油性基質分別選取具有代表性的片劑、口服液、軟膠囊劑為研究對象，實際檢驗樣品均隨機購于蘭州市藥店、成人用品店，于陰涼處存放。

1.2 標準溶液配制

標準品儲備液：準確稱取10種雄性激素標準品各10.00 mg，分別用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成質量濃度為 1.0 mg/mL的各標準品儲備液，于 4 ℃冰箱中保存。

混合標準溶液：分別精密移取各標準品儲備液0.1 mL 置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成質量濃度均為1.0 μg/mL的混合標準溶液，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 固體、液體基質稱取固體基質、液體基質的樣品各0.5 g，置于10 mL離心管中，準確加入10 mL乙腈，渦旋振蕩5 min后，于40 ℃水浴超聲10 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 油性基質稱取油性基質的樣品0.5 g，按上述方法操作，所得上清液置于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋振蕩1 min，靜置分層，棄去上層正己烷溶液，下層溶液過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液(含10 mmol/L乙酸銨)，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。梯度洗脫：0～2.0 min，20% B；2.0～4.0 min，20%～35%B；4.0～6.0 min，35%～40% B；6.0～12.0 min，40%～70% B；12.0～14.5 min，70%～85%B；14.5～17 min,85% B;17～18 min，85%～20% B；18～20 min，20% B。

1.4.2 質譜條件離子源:電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 L/min；霧化氣壓力：241 kPa；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細管電壓：3 500 V；全掃描范圍：m/z50～1 000；參比離子：m/z121.050 9和922.009 8(用于實時校正)，碰撞能量：20 eV。

1.4.3 質譜庫的建立按上述儀器條件，在全掃描模式(MS mode)下對質量濃度均為1.0 μg/mL的10種待測藥物混合標準溶液進行分析，獲得化合物的精確相對分子質量、同位素信息和保留時間，建立一級譜庫。然后在HPLC-Q-TOF MS的MS/MS模式(Targeted MS/MS mode)下分析，得到不同碰撞能量(10、20、30、40 eV)下碎片離子的質譜圖，建立二級譜庫。最后將兩次數據采集的化合物精確相對分子質量、保留時間和碎片離子的質譜圖導入PCDL軟件，完成質譜庫的建立。10種雄性激素的分子式、分子離子理論質荷比、分子離子實際質荷比、產物離子、碰撞能量(CE)等質譜參數見表1。

表1 10種雄性激素的質譜參數Table 1 Mass parameters of the 10 androgen drugs

圖1 2種前處理方法的平均回收率Fig.1 Average recoveries of two sample preparation methods

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

選取具有代表性的片劑、口服液、軟膠囊劑，對比了超聲提取法、液液萃取(LLE)法2種前處理方法的適用性。片劑研磨均勻后取樣，口服液直接取樣，軟膠囊劑取其內容物，精密移取混合標準溶液0.5 mL至以上3種樣品的空白基質中，按“1.3”進行超聲處理和液液萃取。

在2種不同前處理條件下，10種雄性激素的回收率如圖1所示。結果顯示，固體基質和液體基質使用超聲提取法和液液萃取法的回收率均較高，且超聲法操作簡便，基本無損失。油性基質使用超聲提取法的回收率較差，推測是由于油脂未除去導致基質效應增強，因此用正己烷液液萃取將油脂除去，回收率得到很大提升。綜上，固體基質和液體基質前處理選擇超聲提取法，油性基質選擇液液萃取法。

2.2 基質效應評價

將質量濃度均為100 ng/mL的基質標準溶液和溶劑標準溶液分別進樣3針，采用下式評價基質效應(ME)：ME=基質標準溶液的平均響應值/溶劑標準溶液的平均響應值。ME=1.0表示不存在基質效應，0.81.5為強基質效應[17]。使用超聲提取法和液液萃取法分別進行樣品前處理，考察液體、固體、油性3種不同基質的基質效應。結果顯示，采用超聲法，液體基質和固體基質中待測物均為弱基質效應(ME為0.80～1.10)；油性基質中諾龍、去氫睪酮和丙酸睪酮為弱基質效應(ME分別為0.83、1.07、0.81)，氟甲睪酮為強基質效應(ME=0.46)，其余6種待測物為中等基質效應(ME為0.54～0.76)。采用液液萃取法，液體基質和固體基質中待測物均為弱基質效應(ME為0.81～1.08),油性基質中待測物均呈弱基質效應(ME為0.80～1.06)。證明超聲提取法適用于液體基質和固體基質，液液萃取法更適用于油性基質中待測物的提取。

圖2 10種雄性激素的TOF MS篩查流程Fig.2 Screening process of 10 androgen drugs by TOF MS

2.3 快速篩查方法的建立

圖3 諾龍、苯丙酸諾龍和未知化合物的二級質譜圖Fig.3 MS/MS spectra of nandrolone,nandrolone phenylpropionate and unknown compound

圖4 丙酸諾龍的裂解路徑Fig.4 The fragment patterns of nandrolone 17-propionate

因此，通過丙酸諾龍對照品建立其一級以及二級譜庫，將樣品按本方法進行前處理后，進行一級質譜全掃描，與PCDL軟件中已建立的數據庫進行自動檢索，通過精確質量數、保留時間、同位素分布和同位素比例4個指標進行匹配度打分，匹配度為90.3分。再對篩查出的丙酸諾龍可疑化合物進行二級質譜匹配，給予分子離子峰一定能量，通過碎片離子的準確質量數和豐度比進行確認，將PCDL二級數據庫導入定性分析軟件，進行匹配度打分，碎片離子與二級數據庫匹配良好，檢索得分為92.9，因此確證該可疑化合物為丙酸諾龍，同時將其信息添加到初期建立的譜庫中。

使用建立的非法添加物譜庫對未知物進行篩查，可通過與已建立譜庫中的化合物二級質譜對比，推斷出可能的未知化合物，并將此未知化合物進行確認后擴充到已建立的譜庫中，不斷更新譜庫對未知物的篩查能力。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性取空白的固體基質、液體基質、油性基質保健食品按“1.3”進行樣品前處理，再按“1.4”條件進行測定，結果均未檢出待測10種雄性激素，表明空白基質對檢測無干擾。

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量下限精密移取混合標準溶液適量，配制成質量濃度分別為2、10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標準曲線溶液，以各化合物的質量濃度(X，ng/mL)為橫坐標，對應峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明,10種雄性激素在2～500 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.999。將混合標準溶液加入空白基質中，加標濃度逐級遞減，按“1.3”進行樣品前處理，以3倍信噪比時計算檢出限(LOD)，10倍信噪比時計算定量下限(LOQ)。固體基質、液體基質和油性基質中的檢出限為0.01～0.06 mg/kg，定量下限為0.03～0.2 mg/kg(見表2)。

表2 10種雄性激素的線性方程、相關系數、檢出限與定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients,LODs and LOQs of the 10 androgen drugs

2.4.3 回收率與相對標準偏差分別在片劑、口服液、軟膠囊劑的空白基質中加入低、中、高3個不同濃度水平的混合標準溶液，每個濃度平行測定6次，加標回收率和相對標準偏差(RSD)結果見表3。結果顯示，10種雄性激素的平均回收率為74.3%～113%，RSD為1.2%～7.7%。

表3 10種雄性激素在3種保健食品基質中的回收率和相對標準偏差Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of the 10 androgen drugs in three kinds of health food matrices

2.5 實際樣品檢測

應用本方法檢測50批次市售保健食品，按上述方法進行快速篩查，發現1批次樣品含有可疑未知化合物，利用碎片離子進行質譜裂解路徑的推斷，確認該非法添加物為丙酸諾龍，含量為0.13 mg/kg，其色譜圖及質譜圖如圖5所示。丙酸諾龍的檢出量較低，推測該化合物與其他增強體力、改善生長發育類藥物可通過協同作用以增強藥效，減小藥物用量。

圖5 陽性樣品的色譜圖和質譜圖Fig.5 Chromatogram and mass spectra of a positive sampleA.TIC；B.MS spectrum；C.MS/MS spectrum

3 結 論

本研究針對3種具有代表性的保健食品基質，對比了2種前處理方法，通過自行構建的高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜的一級精確質量數據庫和二級譜庫，建立了快速篩查10種雄性激素的檢測方法。該方法操作快速、靈敏、準確，可及時有效地發現保健食品市場中非法添加行為，打擊虛假宣傳行為，降低保健食品安全風險，為行政監管提供有力的技術支持。