分散固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物

沈 霞

(嘉應學院 梅州師范分院，廣東 梅州 514087)

食用菌是可食用的大型絲狀真菌的總稱，含有豐富的蛋白質和氨基酸，受到越來越多人的青睞，食用菌養殖已成為我國農業的重要產業。由于食用菌的生產過程具有密閉、潮濕和不見光等特點，蟲害和菌害一直是影響食用菌產量和品質的主要因素之一。我國GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》允許在生產中使用氟蟲腈、阿維菌素、吡蟲啉、除蟲脲、擬除蟲菊酯、多菌靈、百菌清等殺蟲劑、殺菌劑來防治該類病害，但對最大殘留量做了規定，如氟蟲腈在蘑菇中的最大殘留限量為0.02 mg/kg，且是以氟蟲腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜之和計[1]。目前中國登記用于食用菌的殺蟲劑、殺菌劑品種與國外相比較少[2-3]，食用菌生產中農藥濫用的現象較嚴重[4]。農藥的濫用不僅會造成對食用菌和產地環境的污染，還可能會引起食用菌農藥殘留超標，影響食用者的身體健康。此外，對于部分農藥[5-6]，其代謝產物毒性比母體強，且兩者的協同效應會使毒性增加[7]。因此，研究建立高效準確的同時測定殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物殘留的檢測方法，對于保障食用菌安全具有重要意義。

目前對殺蟲類、殺菌類農藥殘留的研究集中在環境、食品及水果等基質中，食用菌基質也有少量研究報道，但這類研究的檢測對象主要以施用的原藥為主，往往未涉及危害可能更大的代謝物[8-9]。常用的檢測方法包括氣相色譜法(GC)[10-11]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[12]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[13]、高效液相色譜法(HPLC)[14]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[15-17]等。其中，很多殺蟲劑、殺菌劑的代謝物由于性質穩定，不易被氣化，需要衍生后才能用GC、GC-MS或GC-MS/MS分析，衍生化過程繁瑣且重現性差；HPLC法操作簡單，但檢出限高，選擇性差，且易出現假陽性；而LC-MS/MS法的適用范圍廣、選擇性強、靈敏度高，特別是質譜的多反應監測技術可大大提高選擇離子的靈敏度，在痕量分析方面具有很大優勢，適用于食用菌中低含量目標物的檢測[9,18]。我國2016年發布的GB 23200.12-2016[19]和GB 23200.15-2016[20]相關標準，雖包含了氟蟲腈、雙甲脒等部分農藥，但未包含其代謝物及百菌清、福美雙、除蟲脲等化合物。此外標準方法使用固相萃取柱凈化，實驗過程耗時較長。本實驗通過優化分散固相萃取凈化方法以及液相色譜-質譜條件，建立了快速、通用的同時測定新鮮食用菌中19種常用殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析方法，為食用菌安全評價提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20 超高效液相色譜儀串聯AB Triple Quad 5500三重四極桿質譜儀(美國AB Sciex公司)；TurboVap LV氮吹儀(瑞典Biotage公司)；KQ-500D數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；3K15 離心機(德國Sigma公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；MS3渦旋儀(德國IKA公司)。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、咪鮮胺、雙甲脒、噻菌靈、多菌靈、福美雙、馬拉硫磷、噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、百菌清、除蟲脲、樂果、滅蠅胺標準溶液(均為100 mg/L)購自農業部環境保護科研監測所；2,4,6-三氯苯酚(純度大于99%)購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒鹽酸鹽(純度大于98%)購自加拿大TRC公司。乙腈、丙酮(色譜純)購自美國Merck公司；N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化炭黑(GCB)、0.22 μm聚四氟乙烯濾膜購自CNW公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉(分析純)購自廣州化學試劑廠，無水硫酸鎂使用前需在馬弗爐中550 ℃烘干4 h。

樣品：隨機購買本地市售平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、草菇、木耳、銀耳等新鮮樣品共30種，其中平菇4種，香菇5種，金針菇5種，杏鮑菇(雞腿菇)4種，草菇2種，茶樹菇2種，木耳5種，銀耳3種。取樣前混合均勻。

1.2 標準溶液的配制

混合標準中間液：分別稱取或量取適量的待測物標準品或標準溶液，用乙腈-丙酮(體積比1∶1)配成單標儲備液(20.0 mg/L)；然后分別吸取適量的單標儲備液，用乙腈稀釋成混合標準中間液，其中N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒、滅蠅胺、多菌靈、噻蟲嗪、馬拉硫磷的質量濃度為0.5 mg/L，樂果、除蟲脲的質量濃度為2.0 mg/L，其余待測物的質量濃度為1.0 mg/L。

標準工作液：分別吸取10.0、20.0、50.0、100、200、500 μL的混合標準中間液，用空白基質提取液稀釋定容至10 mL，得到系列混合標準工作溶液。

所有標準溶液均保存于4 ℃條件下。

1.3 樣品制備與提取

1.3.1 樣品制備將食用菌樣品切碎混勻，均質成漿，裝入潔凈的容器內，于-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品提取稱取10 g均質后的試樣(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈，然后加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，蓋上離心管蓋，渦旋1 min，振搖提取5 min后，4 200 r/min離心5 min。吸取6 mL上清液加至裝有500 mg無水硫酸鎂、40 mg PSA及40 mg C18的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，準確吸取2 mL上清液于10 mL試管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干。加入1 mL 20%乙腈水溶液復溶，經0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾后，待測定。

1.4 檢測條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS液相色譜柱(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A為乙腈，B為水，梯度洗脫程序：0～3 min，80% B；3～6 min，80%～20% B；6～9 min，20% B；9～9.5 min，20%～80% B；9.5～12 min，80% B。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI+和ESI-同時掃描)；數據采集：多反應監測(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：400 ℃；霧化氣壓力：0.345 MPa；輔助氣壓力：0.414 MPa；氣簾氣壓力：0.138 MPa；去簇電壓：80 V；碰撞室出口電壓：10 V。19種化合物的保留時間、母離子、定性定量離子和碰撞電壓見表1。

表1 19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物的質譜參數Table 1 MS parameters of 19 insecticides，fungicides and their metabolites

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化在多反應監測模式下，對19種待測物的質譜條件進行優化。將目標化合物的單標標準溶液分別在ESI+和ESI-兩種模式下進行掃描。結果顯示，大部分化合物在ESI+模式下易得到[M+H]+準分子離子峰，質譜信號響應較強;對于2,4,6-三氯苯酚、氟蟲腈及其代謝物、除蟲脲，由于其含有酚羥基、三氟甲基等基團，在ESI-模式下得到較高響應的[M-H]-準分子離子峰。選擇各化合物的特征準分子離子峰為母離子進行二級質譜分析，以響應值最大的碎片離子為定量離子，次級響應最大的碎片離子為定性離子，優化質譜參數。19種待測物的最佳質譜條件如“1.4”所示。

2.1.2 流動相的優化使用UPLC-MS/MS檢測時，通常在流動相中加入甲酸、氨水等試劑以提高響應，但由于19種待測物需在ESI+和ESI-兩種模式下同時檢測，為兼顧各化合物的響應，流動相中未使用甲酸、氨水等試劑。對于有機相，分別考察了甲醇和乙腈對目標化合物的分離效果，結果顯示，兩種有機相下目標物的質譜響應相當，但有機相為乙腈時，色譜峰形更好、色譜柱柱壓低，因此選用乙腈作為有機相。綜上，實驗選擇乙腈與水作流動相，此時目標物的檢測靈敏度高，分離度好，可以滿足檢測分析要求。

2.1.3 色譜柱的選擇考察了Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)和Thermo Hypersil GOLD(2.1 mm×100 mm×1.9 μm)4種液相色譜柱對19種待測物的分離效果。結果表明，所有目標化合物在4種色譜柱上均能實現有效保留及分離。實驗選擇低成本的Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)色譜柱進行分離。在最優UPLC-MS/MS檢測條件下，19種待測物的多反應監測色譜圖如圖1所示。

2.2 提取與凈化方法的優化

由于香菇、木耳等食用菌樣品中含有大量黑色素，提取液顏色較深，若提取后直接測定，會對目標物的檢測產生嚴重干擾，因此需對提取液凈化后再上機分析。目前，農藥殘留檢測國家標準中常用的凈化方式有固相萃取(SPE)法和分散固相萃取(QuEChERS)法[19,21]。SPE法操作相對復雜耗時，且常使用甲苯等毒性較大的有機試劑。QuEChERS技術是近年發展起來的一種快速、簡便的樣品前處理技術，方法操作簡單、迅速，且處理過程中避免了毒性較大的有機試劑，因此本實驗采用QuEChERS提取凈化方法。

為提高對提取液pH變化敏感的目標物的萃取效率，實驗采用歐盟推薦的QuEChERS提取方法。在提取過程中加入檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉，形成緩沖鹽體系，不僅能有效提高pH敏感化合物的提取效率，還能防止目標物在提取放熱環境中降解。實驗比較了PSA、C18和GCB 3種QuEChERS材料的不同用量組合(20、40、60 mg)對木耳陰性加標樣品(10 μg/kg)提取回收率的影響，結果見圖2。結果表明：混合吸附劑材料中含有GCB時，所有目標物的提取效率均未超過40%，而吸附劑未含有GCB的樣品組中，目標化合物的回收率均在50%以上，說明加入GCB后，大量目標化合物會被GCB吸附。而對于PSA和C18不同組合，C18用量變化對回收率的影響不及PSA明顯，這是由于C18主要吸附提取液中含量較少的非極性物質，而PSA主要針對含量較多的有機酸、氨基酸、糖類等極性化合物。其中，40 mg PSA/40 mg C18組合時的回收率相對最好，在78%～108%之間，當PSA用量過低時，雜質去除較少，基質效應仍較明顯；當PSA用量較高時，部分化合物被PSA吸附，導致回收率偏低。綜合比較，實驗選取用量均為40 mg的PSA和C18組合凈化木耳樣品。在優化的組合下，對其它基質的加標樣品進行檢測，回收率為82%～104%，可以滿足方法學要求。

2.3 方法驗證

2.3.1 基質效應食用菌樣品的主要成分為水、蛋白質、氨基酸等，大部分基質相對簡單，但由于木耳和香菇樣品中含有大量黑色素，在檢測過程中會干擾目標化合物的響應，相同濃度的基質標準溶液響應僅為溶劑標準溶液響應的42%～54%，基質抑制效應明顯。為消除樣品基質效應，采用陰性樣品提取液配制標準工作溶液，使目標物在標準工作溶液和樣品溶液中均具有相似的離子化環境，確保了檢測方法定性與定量分析的準確性。

圖2 木耳加標樣品中不同用量PSA、C18和GCB組合的回收率對比Fig.2 Recoveries comparison of different combinations of PSA,C18 and GCB in spiked black fungusthe numbers(1-19) denoted were the same as those in Table 1

2.3.2 線性范圍與檢出限在最優的質譜和色譜測定條件下，對“1.2”中19種待測物的系列標準工作液進行測定，以各化合物定量離子的峰面積為縱坐標(y)，對應的質量濃度為橫坐標(x，μg/L)，進行線性回歸計算。代表性基質木耳中目標化合物的線性方程、線性范圍和相關系數見表2，結果表明，19種待測物在一定質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.998 0。

通過測定質量濃度為5.0 μg/L(N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒、滅蠅胺、多菌靈、噻蟲嗪、馬拉硫磷)、10.0 μg/L(雙甲脒、噻菌靈、福美雙、噻蟲胺、吡蟲啉、百菌清、咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜)和20.0 μg/L(樂果、除蟲脲)的標準工作液，計算得到各化合物的信噪比和儀器檢出限，結合前處理過程，最終計算得到各化合物的方法檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)分別為0.2～0.6 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg，其中木耳基質的相關結果見表2。該方法的靈敏度高，適用于食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物的定量分析。

表2 木耳基質中19種待測物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 19 analytes in black fungus

2.3.3 回收率與相對標準偏差由于食用菌種類繁多，基質差異較大，不同品種對方法的回收率影響也不同。因此在最優實驗條件下，選取3類食用菌(香菇、木耳、銀耳)的陰性樣品進行加標回收實驗，考察了方法的回收率和相對標準偏差(RSD)。每類食用菌分別添加3水平的標準溶液，加標濃度分別為1倍、2倍和10倍LOQ，每個濃度平行測定6次，計算回收率及RSD。結果顯示，3類食用菌樣品的加標回收率為83.1%～106%，RSD為5.0%～12%(見表3)。方法的準確度和精密度均能滿足日常檢測定量分析的要求。

表3 19種待測物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 19 analytes(n=6)

圖3 陽性香菇樣品中百菌清的提取定量離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of chlorothalonil in lentinus edodes

2.4 實際樣品的測定

為評價方法的有效性，采用本方法測定了30個市售的平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、草菇、木耳、銀耳等樣品，結果發現1個香菇樣品中檢出百菌清，檢出含量為4.72 mg/kg，其陽性色譜圖見圖3。

3 結 論

本文參照QuEChERS方法，以乙腈溶劑提取，檸檬酸鹽提供緩沖環境，氯化鈉鹽析、無水硫酸鎂除水，PSA和C18組合凈化，經超高效液相色譜-串聯質譜法分離檢測后，可同時測定食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物。實驗通過對檢測條件、樣品前處理及凈化手段的優化，使得該方法在香菇、木耳、銀耳等多種樣品基質中均能得到較好的回收率及重現性。本方法操作簡單、可行性強、回收率高、結果準確、檢出限低，各項方法學技術指標均滿足定性、定量分析要求，適用于食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物的測定，可為食用菌中其它農藥殘留的風險監控提供有效的技術支持。