云南地區非小細胞肺癌EGFR、ALK 和ROS1 基因突變聯合檢測

王 娟，蘇國苗，潘國慶，邊 莉，楊 哲，曾定濤

（1）云南省第三人民醫院檢驗科，云南昆明 650011；2）昆明醫科大學第一附屬醫院病理科，云南 昆明 650032）

目前，肺癌已經成為全球發病率，死亡率最高的腫瘤之一，在我國，特別是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）更是位居惡性腫瘤之首，已嚴重影響人類的健康與生存質量[1-2]。伴隨著我國空氣污染的日益加重、不良的生活習慣及地域壞境變化導致的基因易感性等因素，云南地區的肺癌發病率和死亡率，特別是宣威地區在中國乃至全世界都位居前-，其相關驅動基因研究和個體化治療也越來越受到臨床的關注[3-4]。近年來，針對NSCLC 的分子靶向檢測與治療取得了顯著進展，EGFR、ALK 及ROS1 基因突變聯合檢測在NSCLC 的診治中已成為臨床診斷共識[5-6]。本次研究運用ARMS 法聯合檢測云南地區212 例NSCLC 中EGFR、ALK 及ROS1 基因的突變狀態，分析三者的突變特點及與臨床病理特征的關系，為下一步臨床NSCLC 患者的個體化靶向治療提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用隨機抽樣收集2016 年7 月至2019 年7 月昆明醫科大學第一附屬醫院經病理學確診的云南地區NSCLC 樣本212 例，其中男性84 例，女性102 例；年齡范圍27～90 歲，中位年齡55 歲；腺癌202 例、鱗癌8 例、腺鱗癌2 例。所有患者均未經過放化療、靶向藥物治療等抗腫瘤治療。

1.2 樣本采集及DNA 提取

病理醫師鏡下篩片進行腫瘤定位后，調取蠟塊進行切片（厚度：6～10 μm，數量8～12 片），然后用鑷子移至干凈的1.5 mL 離心管中。使用廈門艾德生物醫藥有限公司的石蠟組織DNA 和RNA 提取試劑盒，按照說明書提取石蠟組織腫瘤樣本的DNA 和RNA，最后紫外分光光度計（Amony Dx SMA4000）測定樣本DNA 或RNA 濃度。

1.3 EGFR、ALK 和ROS1 基因檢測

將待檢樣本的DNA 和RNA 嚴格按說明書配比稀釋，采用美國安捷倫公司QPCR 儀（型號：mx3000p），依據突變擴增阻滯系統（ARMS 法）的原理檢測EGFR、ALK 及ROS1 基因。檢測試劑盒均采用廈門艾德生物醫藥有限公司，每次實驗均設定陰、陽對照及內參照，并根據試劑盒說明書判讀結果。

1.4 統計學處理

采用SPSS 軟件進行統計學分析EGFR、ALK、ROS1 三基因突變率及與NSCLC 患者臨床病理特征的關系，采用χ2進行檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、ALK、ROS1 三基因突變特點

212 例NSCLC 標本中，檢出EGFR 基因突變108 例（50.9%），其中G719X 檢測到突變4 例（3.7%）；19-del 檢測到突變36 例（33.4%）；Exon20 檢測到突變2 例（1.9%）；L858R 檢測到突變46 例（42.6%）；S768I 檢測到1 例（0.9%）；G719X 和S768I 雙突變13 例（12.0%）；19-del 與T790M 或Exon20 雙突變2 例（1.8%）；L858R 與S768I 或T790M 雙突變3 例（2.8%）；19-del、L858R、S768I 共突變1 例（0.9%）。因此，云南地區EGFR 突變類型主要以19-del 和21 號L858R 點突變為主，其中G719X 和S768I 雙突變13 例（12.0%）（表1、圖1、圖2），突變比例較高，經筆者前期臨床跟蹤調查發現，主要集中于云南宣威地區，突變率高達35%，國內相關文獻報道較少，有待進一步研究。

在212 例非小細胞肺癌標本中，共檢出ALK基因突變10 例（4.7%），檢出ROS1 基因突變4例（1.89%）（表1、圖3、圖4）。

表1 EGFR、ALK、ROS1 三基因突變類型及比例（n）Tab.1 Mutation types and proportions of EGFR,ALK and ROS1 genes （n）

圖1 108 例NSCLC 患者EGFR 基因不同位點突變率示意圖Fig.1 Schematic diagram of mutation rate of EGFR gene at different loci in 108 NSCLC patients

圖2 ARMS 法檢測EGFR 基因突變Fig.2 EGFR gene mutation was detected by ARMS

圖3 ARMS 法檢測ALK 融合基因突變Fig.3 ALK fusion gene mutation detected by ARMS

圖4 ARMS 法檢測ROS1 融合基因突變Fig.4 ROS1 fusion gene mutation was detected by ARMS

2.2 EGFR、ALK、ROS1 基因突變與臨床特征關系分析

云南地區212 例NSCLC 患者EGFR 基因突變數據統計分析：男性患者的EGFR 突變率為43.6%，明顯低于女性患者58.8%，差異有統計學意義（P=0.027）；＞55 歲患者EGFR 突變率為47.6%，≤55 歲患者EGFR 突變率為54.1%，兩者之間的差異無統計學意義（P=0.340）；有吸煙患者為38.9%，無吸煙史患者EGFR 基因突變率為59.8%，二者比較差異有統計學意義（P=0.003）；202 例腺癌患者中107 例發生突變（52.9%），與鱗癌及腺鱗癌比較差異有統計學意義（P=0.003）；8例鱗癌患者均未發生EGFR 基因突變；2 例腺鱗癌患者中1 例發生EGFR 基因突變（50.0%）（表2）。

云南地區212 例NSCLC 病例ALK、ROS1 融合基因突變數據統計分析：ALK 融合基因突變率為4.7%（10/212），ROS1 融合基因突變率為1.9%（4/212），其突變與患者性別、年齡、吸煙史、組織學類型均無關（P＞0.05，表2）。

表2 EGFR、ALK、ROS1 基因突變與NSCLC 臨床病理特征的關系（n）Tab.2 Correlation between EGFR,ALK and ROS1 gene mutations and the clinicopathological characteristics of NSCLC （n）

3 討論

EGFR、ALK 及ROS1 基因聯合檢測目前是輔助臨床NSCLC 個體化治療的重要參考依據[7-8]。表皮生長因子受體（EGFR）是屬于酪氨酸激酶I 型受體，廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、膠質細胞、成纖維細胞等細胞表面，是上皮生長因子（EGF）細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR 等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡有著密切的關系[9-10]。因此通過檢測NSCLC 患者EGFR 基因突變狀態可以有效指導EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（吉非替尼、阿法替尼及奧西替尼等）的臨床靶向治療。ALK 基因屬于胰島素受體家族，通過基因重排而活化，進而激活下游信號通路導致癌變發生，可與多種基因發生融合，其中EML4-ALK 融合基因最為常見[11-13]，目前應用于ALK 陽性NSCLC 患者的靶向藥物有克唑替尼、色瑞替尼和艾樂替尼[14]。ROS1 基因定位于6q21 染色體，在NSCLC 中主要與CD74、SLC34A 發生融合，激活ROS1 酪氨酸激酶區及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK 等信號通路，進而引起腫瘤的發生[15-16]。ROS1 融合基因重排的患者在使用ALK 抑制劑均有顯著療效，其中第一代ALK 抑制劑克唑替尼已被臨床廣泛用于NSCLC 患者ROS1 基因重排的治療并取得顯著的療效[17-18]。

本次研究分析顯示：云南地區EGFR 突變率為50.9% （108/212），主要以19-del 和21 號外顯子L858R 位點突變為主，突變率為76.0%（82/108）；女性突變率為58.8% （60/102）高于男性突變43.6%（48/110），（P=0.027）；無吸煙史突變率為59.8% （73/122）明顯高于有吸煙史38.9%（35/90），（P=0.003）；腺癌突變率為52.9%（107/202）與鱗癌及腺鱗癌組織類型比較差異有統計學意義（P=0.003），而與年齡無明顯關系（P=0.34），和目前亞洲人群中EGFR 基因突變約為30%～51%，主要發生于酪氨酸激酶區域的18～21外顯子，占所有突變的90%左右的文獻報道一致[19]。此次分析發現，G719X 和S768I 位點雙突變為12.0%（13/108），追蹤患者居住史全部來源于云南宣威地區，目前國內相關文獻報道較少，可能與其獨特的流行病學有關，宣威地區具有以含有苯并（A）芘為代表的多環芳烴類物質的室內煤煙排放環境、多基因遺傳、個體易感性、肺部疾病特點等[20]，因此，有待進一步跟蹤研究。綜上所述，云南昆明地區NSCLC 患者EGFR 基因突變主要以19-del 和L858R 為主，多見于女性、無吸煙史、腺癌患者。

既往研究表明，ALK 融合基因重排在非小細胞肺癌（NSCLC）中多發生于女性、腺癌、無吸煙史的患者，突變率為0.4%～11.6%，中國人群的陽性率約為5.9%[21]；ROS1 融合基因重排突變率約為1%～2%，在年輕、不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者中陽性率較高，在鱗狀細胞癌中也有報道[22-24]；EGFR 與ALK 或EGFR 與ROS1 可以發生共突變[25-26]。本次數據分析顯示：ALK、ROS1 融合基因重排突變率分別為4.70% （10/212）和1.89%（4/212），與上述報道一致，但未發現EGFR 與ALK 或EGFR 與ROS1 的兩兩共突變，并且ALK和ROS1 突變與其臨床病理學特征（性別、年齡、吸煙史、組織學分型）差異無統計學意義，可能與研究樣本數量較少、突變率低等因素有關，有待進一步擴大樣本數據量分析研究。

綜上所述，云南地區NSCLC 患者EGFR 基因突變多見于女性、無吸煙史、腺癌患者，主要以19-del 和L858R 突變為主，其中宣威地區發現13例G719X 與S768I 位點少見雙突變，其可能與民族、遺傳背景、環境等因素有關，有待進一步跟蹤調查；ALK、ROS1 融合基因突變率較EGFR 低，且與臨床病理特征差異無統計學意義，可能與檢測樣本數量、突變率低等因素有關；針對EGFR、ALK、ROS1 基因之間的突變特點的相關性及臨床靶向用藥的療效有待進一步隨訪研究，進而為NSCLC 患者的個體化治療方案的選擇提供重要的參考依據。