沉默Bin1 基因對膀胱尿路上皮癌T24 細胞生物學功能的影響

羅 丹，楊承綱

（昆明醫科大學第三附屬醫院/ 云南省腫瘤醫院病理科，云南昆明 650118）

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，其中膀胱尿路上皮癌占90%以上，具有復雜多變的生物學行為，突出表現為易復發、多發、浸潤和轉移。目前，針對膀胱癌的主要治療手段是手術切除以及放化療，但膀胱癌的高復發率使得治療效果不理想，因此，尋找特異性分子靶向治療對提高膀胱尿路上皮癌的臨床預后具有重要意義。橋接整合因子1（bridging integrator-1，Bin1）亦稱Amphiphysin2,是一種C-myc N-末端連接蛋白，在多種腫瘤中表達異常，且Bin1 的表達異常與癌的進展有關[1]，但在膀胱尿路上皮癌中的作用機制尚未明確。該研究旨在觀察沉默Bin1 基因對膀胱尿路上皮癌T24 細胞在體內外生長的影響，初步探討Bin1 在膀胱尿路上皮癌細胞中的基因調控作用，有助于揭示Bin1 與膀胱尿路上皮癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

T24 細胞、shRNA 病毒、陰性對照病毒購于上海吉凱有限公司；CCK8 試劑盒、PI 核酸熒光染料購于Sigma 公司；凋亡試劑盒購于eBioscience 公司；裸鼠購于上海靈暢生物科技有限公司;熒光顯微鏡為日本Olympus 公司；倒置顯微鏡為上海蔡康光學儀器有限公司；流式細胞儀為Millipore 公司。

1.2 細胞培養與慢病毒感染

膀胱尿路上皮癌細胞株T24 采用10%的胎牛血清的RPMI-1640 基培養，培養條件37℃、5%CO2。培養生長狀態良好的T24 細胞，依據《慢病毒感染細胞手冊》[2]對其進行感染。實驗隨機分為實驗組（KD 組，轉染Bin1 基因的shRNA 病毒，能沉默Bin1 基因）和陰性對照組（NC 組，轉染陰性對照病毒），感染后第72 h 檢測感染效率并進行后續試驗。

1.3 細胞活力檢測（CCK8 法）

將處于對數生長期的兩組細胞制備成細胞懸液，并接種于96 孔板，再置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養。待細胞貼壁后24、48、72、96、120 h，加入10 μL CCK-8 試劑于孔中，并繼續培養4 h。用酶標儀測定波長為450 nm 的光的吸光率（OD450 nm 值），然后繪制曲線。

1.4 流式細胞凋亡檢測

將兩組T24 細胞接種于6 孔板，待細胞生長至覆蓋率約為70%時，制備成細胞懸液，收集全部細胞于離心管中，每組設三個復孔，離心棄上清后洗滌細胞沉淀，用結合緩沖液重懸細胞，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光15 min，上機檢測。

1.5 流式細胞周期檢測法

將兩組細胞生長至覆蓋率約為80%時（細胞未進入生長平臺期），消化收集細胞，每組設三個復孔，離心棄上清后洗滌細胞沉淀，用75%的乙醇進行固定，離心去固定液，再次洗滌細胞沉淀，用無RNA 酶的碘化丙啶染色液對細胞進行染色后，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，繪制直方圖。

1.6 克隆形成實驗

將處于對數生長期的兩組細胞消化制備成細胞懸液，按照800 個細胞/孔接種于6 孔板中，每個實驗組設3 個復孔。置于培養箱中培養16 d 后，多聚甲醛固定細胞克隆，GIMSA 染色后，拍照計數，計算各組細胞克隆形成數。

1.7 裸鼠皮下成瘤實驗

取適應性飼養4 周裸鼠20 只，均為雌性，隨機分為兩組:實驗組及對照組，每組10 只。取對數生長期的轉染了Bin1 基因的shRNA 病毒與陰性對照病毒的T24 細胞懸液200 μL（含活細胞數1×107）分別注射到兩組小鼠皮下，構建裸鼠皮下成瘤模型。從細胞注射開始，每天觀察裸鼠的生長狀態及成瘤情況，繪制腫瘤生長曲線，41 d 后處死兩組成瘤裸鼠，取腫瘤測量體積、稱重記錄、比較及分析。

1.8 統計學處理

采用SPSS 統計軟件，計量資料符從正態分布，以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24細胞增殖的影響

采用CCK8 法分析沉默Bin1 基因的表達對細胞增殖的影響。OD450 在這里反映了具有活力的細胞的數量。實驗結果顯示:相比對照組，從第1～5 天，實驗組細胞增殖減緩（圖1），沉默Bin1 基因表達能夠抑制膀胱尿路上皮癌細胞的增殖活性[NC vs KD:（1.28±0.67）vs（0.74±0.15），P＜0.001]。

圖1 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of silence of Bin1 gene on the cell proliferation in T24 cells

2.2 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24細胞凋亡的影響

細胞凋亡實驗結果顯示：相比對照組，試驗組凋亡數增多（圖2），說明沉默Bin1 基因表達可以促進膀胱尿路上皮癌T24 細胞凋亡[NC vs KD:（4.31±0.17）vs（6.41±0.54），P＜0.01]。

圖2 沉默Bin1 的表達對膀胱尿路上皮癌T24 細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of silence of Bin1 gene on the cell apoptosis in T24 cells

2.3 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24細胞周期的影響

通過流式細胞術分析沉默Bin1 表達對細胞周期進程的影響。實驗結果顯示：相比對照組，實驗組處于S 期的細胞減少（P＜0.05），處于G1、G2/M 期的細胞增多（P＜0.05，圖3），說明沉默Bin1 基因的表達對T24 細胞周期有一定的調節作用。

圖3 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24 細胞周期的影響Fig.3 The effect of silence of Bin1 gene on the cell cycle progression in T24 cells

2.4 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24細胞克隆形成的影響

克隆實驗結果顯示：相比對照組，實驗組細胞克隆數顯著減少（P＜0.001，圖4）。結果表明，沉默Bin1 基因的表達能抑制T24 細胞克隆形成的能力。

圖4 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24 細胞克隆形成的影響Fig.4 Effect of silence of Bin1 gene on the colony formation in T24 cells

2.5 沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌T24細胞裸鼠皮下成瘤性的影響

處死小鼠，觀察裸鼠成瘤情況，結果顯示：與對照組比較，實驗組的裸鼠移植瘤體平均體積明顯減小（P＜0.05，圖5），實驗組瘤體重量減小（P＜0.05，圖6），繪制腫瘤體積生長曲線，可以發現實驗組腫瘤生長速度減慢（P＜0.05，圖7）。這提示沉默Bin1 基因的表達能抑制膀胱尿路上皮癌T24細胞種植瘤在裸鼠體內的生長。

圖5 實驗組與對照組T24 裸鼠種植瘤大小(種植瘤照片)Fig.5 Effect of silence of Bin1 gene on the colony formation in T24 cells （the photo of planted tumors）

圖6 實驗組與對照組T24 裸鼠種植瘤重量Fig.6 The weight of planted T24 tumors in NC and KD group

圖7 腫瘤體積生長曲線Fig.7 Tumor growth curves

3 討論

惡性腫瘤的發生發展通常與癌基因的激活、抑癌基因的失活缺失密切相關。Bin1 因具有抑癌作用的配體蛋白而被發現[3]，能廣泛表達于正常細胞中，但在多種惡性腫瘤中低表達或缺失[4-7]，多個研究中發現Bin1 能促進腫瘤細胞凋亡[8]、抑制細胞周期[9]、抑制細胞增殖[4，10]，并與腫瘤轉移[11]、腫瘤免疫逃逸與治療[12-14]、腫瘤耐藥[9，15]、DNA 修復相關[1]，具有影響癌癥的進展及預后的作用[1]。該實驗通過慢病毒沉默Bin1 基因的表達對膀胱尿路上皮癌細胞的生物學功能進行研究。實驗中采用了CCK8、細胞周期、細胞凋亡、克隆形成等方法，結果發現沉默Bin1 基因可以使膀胱尿路上皮癌T24 細胞的增殖活性降低、凋亡增多、體外成瘤能力降低（克隆形成減少）；且通過構建裸鼠皮下成瘤模型，發現沉默Bin1 基因的表達能使T24 細胞體內成瘤能力降低，此外，還發現Bin1 對T24 細胞周期具有一定的調節作用。此次試驗證明Bin1 有促進膀胱尿路上皮癌細胞的生長作用，與Bin1 抑癌的作用相互矛盾。這種矛盾的表現，推測具有以下可能：（1）基因在腫瘤的生長進展中有多個腫瘤通道及多個基因調控，單個基因的沉默后可能出現的預期結果被其他基因的作用而掩蓋；（2）Bin1 在膀胱尿路上皮癌中可能具有一定的組織特異性。

綜上所述，沉默Bin1 基因的表達能夠明顯影響膀胱尿路上皮癌T24 細胞的增殖、凋亡、周期進展、體內外成瘤能力，這表明Bin1 在膀胱尿路上皮癌細胞株T24 中具有重要作用，它可能與膀胱尿路上皮癌的進展相關，為進一步深入研究膀胱尿路上皮癌的發生發展機制提供了一定實驗基礎。