內置式雙向電極觀察先天性巨結腸動物模型腸電圖

李霽偉，謝余澄

（昆明市兒童醫院病理科，云南昆明 650228）

無神經節細胞性巨結腸病（hirschsprung’s disease，HD），是一種嚴重危害嬰幼兒健康的先天性消化道畸形[1]。主要病理變化是一段結腸壁內缺乏神經節細胞，從而無法誘導該段結腸神經動作電位無法形成和傳導，致使腸道持續性痙攣，腸腔狹窄，內容物儲留，繼發性腸炎等一系列嚴重消化道癥狀[2]。基礎研究已經表明，胃腸道擁有多個起搏點均能自主發放節律性慢波，延胃腸道平滑肌向遠端傳播。本研究在改良的HD 動物模型基礎上，采用自主研發的腸道內置式雙向電極，觀測和接收HD 模型乳鼠不同腸道內電生理及腸電圖改變，并與組織病理學檢查診斷對比分析，探討內置式雙向電極在HD 診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級SD 大鼠60 只，2 月齡，體重（220±10）g，雌雄各半，購自于昆明醫科大學動物實驗室，并委托飼養至性成熟后繁殖的4～5 日齡乳鼠80 只。

1.1.2 試劑 PHOX2B 兔抗人多克隆抗體ImmunoWay Biotechnology Company。

1.1.3 儀器 電刺激儀（model A310）及電隔離儀（Stimulus Isolator，model A365）美 國 World Precision Instruments，Inc（Sarasota，Florida）；生物信號采集處理系統（MedLab－U/8c502）中國南京美易科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HD 動物大鼠模型的建立和分組 新生4～5 日齡SD 乳鼠40 只為實驗組，乙醚麻醉，在無菌條件下腹部正中切口提出乙狀結腸，將0.5%BAC溶液浸泡過濾紙條（1.5 cm×1 cm）緊貼腸壁環形包繞結腸1 周，每5 min 滴加50 μL 的0.5%BAC溶液于濾紙上，保持濾紙濕潤。60 min 后移去濾紙條，清潔腹腔，還納腸管，關閉腹腔，注射用青霉素鈉粉劑涂切口。對照組40 只，手術方式同實驗組，用生理鹽水代替0.5%BAC 溶液，作用時間及計量同實驗組。術后第1 周實驗組開始出現腹脹，至術后第2 周實驗組均出現不同程度的排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，糞便顆粒比對照組干燥且明顯變小，處死后大體解剖可見BAC 處理結腸段腸管狹窄痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內容物潴留。

1.2.2 常規HE 染色觀察神經節細胞 病理常規HE 染色操作步驟，HD 模型乳鼠腸道組織標本切片顯色，觀察著色后神經節細胞在腸道的正常段、移行段和狹窄段的分布和數量。

1.2.3 免疫組織化學PHOX2B 抗體在神經節細胞中的特異表達 S-P 免疫組織化學方法操作步驟，PHOX2B 抗體在HD 模型乳鼠腸道組織標本切片上顯色，觀察PHOX2B 著色后神經節細胞在腸道的正常段、移行段和狹窄段的分布和數量。

1.2.4 腸道電生理檢測 經肛門將三對固定在腸道中空球囊上的環狀電極放于HD 實驗組病變腸道的正常段、移行段和狹窄段內，電極間間距為0.5 cm。而對照組乳鼠，環狀電極放入直腸內距肛門外緣2 cm。通過生物信號采集處理系統（MedLab－U/8c502）分別記錄正常段、移行段和狹窄段腸道傳導電信號。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件對收集的數據進行統計學處理。定量資料服從正態分布的用（）描述，不服從正態分布的用P50（P25，P75）描述，進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，滿足正態性及方差齊性的多組間比較采用單因素方差分析；不滿足正態性或方差齊性的定量資料，組間比較采用Kruskal Wallis H 檢驗。如果多組建比較有差異，采用Bonferroni 法進行兩兩比較。兩個定量變量的相關性分析，對不符合正態分布的定量資料，采用Spearman 秩相關系數（rs）。檢驗水準為雙側α=0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。組間兩兩比較檢驗水準調整為雙側α=0.0167，即P＜0.0167 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HD 幼鼠模型鑒定

分別取對照組乙狀結腸正常段，實驗組乙狀結腸狹窄段和移行段，做病理常規HE 染色，觀察腸壁肌間神經叢內神經節細胞形態（圖1A-C），計數正常段、移行段和狹窄段神經節細胞數量（表1），其中正常段與移行段的細胞數量不服從正態分布，分別為5（4，6），1（1，2），正常段細胞數量多于移行段（H=39.70，P＜0.001）與狹窄段（H=79.85，P＜0.001），移行段細胞數量多于狹窄段（H=40.15，P＜0.001），證實成功構建HD 乳鼠實驗動物模型。

圖1 不同階段腸道神經節細胞形態（HE×400）Fig.1 Morphology of intestinal ganglion cells in different segments（HE×400）

表1 HE 染色肌間神經節細胞數量[P50（P25，P75）]Tab.1 The number of intramuscular ganglion cells stained by HE[P50 （P25，P75）]

2.2 PHOX2B 抗體特異性表達

顯微鏡下觀察PHOX2B 抗體著色于神經節細胞的胞漿與胞核（圖2，A-C），計數正常段、移行段和狹窄段神經節細胞數量（表2），分別為5.20±0.88，2.03±0.73，0，正常段細胞數量多于移行段（H=40.00，P＜0.001）與狹窄段（H=80.00，P＜0.001），移行段細胞數量多于狹窄段（H=40.00，P＜0.001），證實成功構建HD 乳鼠實驗動物模型，并且PHOX2B 抗體著色下神經節細胞數量與HE 染色觀察數量相符。

2.3 不同階段腸道電生理測定

經腸道內置雙向電極引導和MEDLAB 生物信號采集系統顯示正常段、移行段和狹窄段腸道腸電圖電信號（圖3，A-C），記錄各段生物電信號強弱（表3），分別為76.94±9.06，15.40±5.03，2.5（1.8，3.7），正常段腸道電壓高于移行段（H=41.08，P＜0.001）與狹窄段（H=78.93，P＜0.001），移行段腸道電壓高于狹窄段（H=37.85，P＜0.001）。

圖3 不同節段腸道的腸電圖形態和強度Fig.3 Morphology and intensity of electroenterogram in different segments of intestinal tract

表3 腸電圖不同節段電壓[（）或P50（P25，P75）]Tab.3 The voltage of different segments in electrointestinogram[（）或P50（P25，P75）]

表3 腸電圖不同節段電壓[（）或P50（P25，P75）]Tab.3 The voltage of different segments in electrointestinogram[（）或P50（P25，P75）]

與狹窄段腸管比較，△P＜0.001；與移行段腸管比較，▲P ＜0.001。

2.4 神經節數量與電壓幅度相關性分析

不論HE 染色，還是PHOX2B 染色觀察下，神經節細胞數量與腸道電壓強度存在正相關，即細胞數量越多，接收電壓越大（rs=0.903，P＜0.001；rs=0.907，P＜0.001），見表4。

表4 神經節細胞數量與接收電壓的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of ganglion cell number and intestinal voltage

3 討論

HD 作為嬰幼兒先天性消化道畸形之一，其發病率在1:2 000～5 000，我國約為1:2 500，平均男與女之比為4:1，新生兒發病率逐年攀升[3]。多年來對HD 的診斷完全依賴于常規病理，盡管診斷方式不斷更新，從最初的常規HE、免疫組織化學染色、冰凍到乙酰膽堿酯酶觀測，再到基因學篩查，然而對HD 的誤診率依然較高[4-6]。此外，還缺乏動態的、連續性的、廣泛及直觀的對HD 和腸道神經節細胞的有效監測手段。

胃腸道電生理學的發展，為研究和探索消化道機能開辟了一條新的途徑。早在1922 年，Alvarez首次報道從人體表記錄到胃電活動[7]。1957 年，Davis 等敘述了經皮膚電極從腹部記錄胃電活動的技術，并且深入探討了呼吸、運動偽跡、心電等信號對胃電的干擾，以及食物、休息、視覺刺激等因素對胃電圖的影響[8-9]。此后，于1959 年Tiemann F和 Reichertz P[10]正式提出“ 胃電圖 "（electrogastrogram，EGG）以及腸電圖（electrointestinogram，EIG）的名稱。1983 年，美國心理生理學會以“胃電圖及其意義”為專題，編輯出版了名為《胃電圖及其臨床應用》的專著[11]，系統性的介紹了胃電圖的原理、方法、發展歷史和新近的研究成果。1993 年，國際胃電圖學術會議在波士頓舉行，主旨介紹了胃電圖信號的獲取和分析、數學模型及儀器的微型化[12]。1999 年廈門的胃電圖學術會議制定了我國的胃電圖診斷標準（草案）[13]，目前對于胃電圖的檢測及研究工作不斷發展，動態胃電圖儀的推出也使得這一檢測方法日趨成熟[14]。然而，國內外對兒童消化道運動與胃腸電圖的關系、節律紊亂等研究較少，進展緩慢，其中專門針對HD 的研究和動物模型建立更為少見[15-17]。

回顧過去研究，兒童消化道疾病問題是基于成人胃腸電圖研究的總結，依然停留在體表引導電信號而非直接體內引導及動態觀察，也并沒有從病理診斷HD 標準角度來考慮病因與腸電圖之間的關系。因此，基于消化道解剖結構開放性的特點，筆者改良并建立了HD 乳鼠實驗動物模型，并采用腸道內置式雙向電極觀察，發現正常段、移行段和狹窄段腸壁引導出的腸電圖電信號強度有差異，特別是正常段與狹窄段差異顯著（P＜0.001）。同時，HD 模型組幼鼠伴發有排便次數減少、便細、腹脹等一系列臨床癥狀。而經HE 和PHOX2B 抗體染色證實，移行段內神經節細胞數量明顯減少，細胞發育幼稚，胞漿稀少，核仁不明顯，特別是狹窄段內神經節細胞消失，僅見增生粗大的神經叢。腸電圖電信號強弱與神經節細胞的數量、形態及分布呈正相關（P＜0.05），即神經節細胞數量越少，電壓強度越小；反之，電壓強度越大，神經節數量越接近正常腸道。特別重要的是狹窄段電信號極弱，無法形成能有效觀察的腸電圖，這一特點將是筆者研究腸電圖信號為診斷HD 提供的重要參考依據。此外，內置式設計能較為持續和動態的觀察到了腸道內的變化，在免除有創性標本采樣的同時，降低了手術風險和術后并發癥，大幅度提高了幼鼠生存率。

本研究在前期工作的基礎之上證實了神經節細胞數量與電信號強弱的相關性，希望為臨床提供一種行之有效的、無創性的診斷HD 途徑。而本實驗還存在有異位電信號干擾，選擇更為合理的動物建立模型及HD 病因機制不清等諸多不足，待進一步深入研究。