干擾SNHG7對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

任永強 李慶華 黃新建

(河南科技大學臨床醫學院，洛陽 471003)

瘢痕疙瘩是良性皮膚腫瘤，影響患者外觀、損害患者身心健康，主要表現為成纖維細胞的異常增殖及膠原過量沉積[1]。瘢痕疙瘩的治療方法主要為手術、放化療及激光治療等，但療效不甚滿意，藥物綜合治療成為研究熱點，闡明瘢痕疙瘩的發病機制有利于新靶向藥物的開發[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)不僅參與細胞生長、發育等過程，還參與調控纖維化多種生物學過程，有望成為器官纖維化診斷和預后的分子標志物及藥物作用新靶點[3]。小核仁RNA宿主基因7(small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7)隸屬于lncRNA，在多種腫瘤中高表達，發揮致癌基因作用，如SNHG7在膠質母細胞瘤組織和細胞系中高表達，促進其增殖、侵襲和遷移，在食管癌組織和細胞中高表達，促進食道癌細胞增殖并抑制凋亡，在胃癌組織和細胞中高表達，干擾其表達可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[4-6]。但SNHG7在瘢痕疙瘩中的表達及其對瘢痕疙瘩的影響尚未闡明。研究發現miRNA參與皮膚疾病和創傷修復的發生發展，瘢痕疙瘩中異常表達的miRNA參與增生性瘢痕形成[7]。miR-122修飾可增強脂肪組織間充質干細胞對肝纖維化的治療功效[8]。miR-122在胃癌組織和細胞系中均低表達，與患者侵襲性臨床病理特征顯著相關，miR-122過表達明顯抑制胃癌細胞系增殖、侵襲和遷移[9]。盧玲[10]用miRNA基因芯片技術檢測瘢痕疙瘩與正常皮膚組織差異表達的miRNA基因，發現miR-122在瘢痕疙瘩中表達下調，說明miR-122可能與瘢痕疙瘩發生發展相關，但miR-122對瘢痕疙瘩的影響尚未闡明。本實驗研究SNHG7和miR-122對瘢痕疙瘩成纖維(keloid fibroblast，KF)細胞增殖、凋亡的影響及作用機制，為瘢痕疙瘩治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織來源 正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織取自我院整形外科手術患者的全厚皮膚移植術后的剩余皮片，術前未經任何治療，且經臨床和病理診斷為瘢痕疙瘩，所有患者知情同意。正常皮膚組織33例，瘢痕疙瘩組織36例。

1.1.2試劑 胎牛血清、DMEM培養基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自碧云天生物技術研究所；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；載體質粒購自北京普瑞金科技有限公司。

1.2方法

1.2.1KF細胞分離培養 無菌條件下除去人瘢痕疙瘩組織表皮及脂肪，用含100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的PBS洗3次，剪碎成組織微粒，DMEM培養基置于37℃、5%CO2恒溫箱培養，每2～3 d換液1次，1周后顯微鏡下觀察，待組織微粒周圍有梭形細胞游出后，吸去組織塊和培養液，換新鮮培養液繼續培養，HE染色鑒定為KF細胞后繼續培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2細胞轉染和分組 取對數生長期KF細胞用無血清培養基同步化12 h，調整細胞密度為4×105個/ml，將si-NC、si-SNHG7、pcDNA3.1、pcDNA3.1-SNHG7、miR-NC、miR-122分別轉染至KF細胞，記為si-NC組(SNHG7陰性對照組)、si-SNHG7組(SNHG7抑制表達組)、pcDNA3.1組(SNHG7陽性對照組)、pcDNA3.1-SNHG7組(SNHG7過表達組)、miR-NC組(miR-122陽性對照組)、miR-122組(miR-122過表達組)；將si-SNHG7分別與anti-miR-NC、anti-miR-122共轉染至KF細胞，記為si-SNHG7+anti-miR-NC組(miR-122陰性對照組)、si-SNHG7+anti-miR-122組(miR-122抑制劑組)，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作。

1.2.3RT-qPCR檢測SNHG7和miR-122表達 取各組對數生長期細胞以5×104個/ml接種于96孔板，100 μl/孔，培養48 h后按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉錄為cDNA，SNHG7和miR-122分別以GAPDH和U6為內參進行PCR擴增，每個樣品設3個 復孔。循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。2-ΔΔCt法計算。SNHG7 F：5′-GTTGGGGTGTTGGGCATTCTTGTT-3′，R：5′-TGGTCAGCCTGGTCACTCTGG-3′；GAPDH F：5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′，R：5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；miR-122 F：5′-ACCTCACACTGTTACCACAAA-3′，R：5′-CAGCATAGGTCACGTCCCAG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4Western blot檢測CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達 取各組對數生長期細胞以5×104個/ml接種于96孔板，100 μl/孔，培養48 h后提取細胞總蛋白，BCA試劑盒定量。將蛋白樣品經電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入相應的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；再加入二抗，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，暗室中曝光顯影，定影，Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個復孔。

1.2.5MTT試劑盒檢測細胞增殖抑制率 取各組對數生長期細胞以5×104個/ml接種于96孔板，100 μl/孔，培養24、48、72 h時分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h；棄培養液，150 μl/孔加入DMSO后振蕩15 min，酶標儀于490 nm處檢測各孔吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%，每組重復3次取平均值。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養48 h后用不含EDTA的胰酶消化，離心收集細胞，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞，調整細胞密度至5×105個/ml，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處熒光強度，重復3次。

1.2.7熒光素酶報告基因實驗檢測SNHG7對miR-122的靶向調控 構建SNHG7 3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-SNHG7和MUT-SNHG7，LipofectamineTM2000試劑盒將WT-SNHG7、MUT-SNHG7質粒分別和miR-NC和miR-122共轉染至KF細胞(細胞融合度約為60%)，按照說明書操作，實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析，重復3次。

2 結果

2.1SNHG7、miR-122在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中的表達 與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織SNHG7表達顯著升高，miR-122表達顯著降低(P<0.05)，見表1。在瘢痕疙瘩組織中SNHG7高表達，miR-122低表達，SNHG7與miR-122表達呈負相關，見圖1。

2.2抑制SNHG7對KF細胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-SNHG7組KF細胞中SNHG7表達顯著降低，CyclinD1、Bcl-2表達顯著降低，P21、Bax表達顯著升高，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2、3。提示抑制SNHG7表達可抑制KF細胞增殖，促進其凋亡。

2.3SNHG7靶向調控miR-122 StarBase預測軟件顯示SNHG7與miR-122存在結合位點，見圖3。熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC組(0.97±0.09)，miR-122組轉染SNHG7野生型表達載體的細胞KF的熒光素酶活性(0.22±0.02)顯著降低(P<0.05)，而與轉染SNHG7突變型表達載體的KF細胞的熒光素酶活性(0.99±0.10)差異無統計學意義，與pcDNA3.1組(1.00±0.10)相比，pcDNA3.1-SNHG7組miR-122表達顯著降低；與si-NC組(1.02±0.01)相比， si-SNHG7組miR-122表達(1. 57±0.16)顯著升高(P<0.05)。SNHG7可靶向調控miR-122表達。

表1 SNHG7、miR-122在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中的表達

圖1 SNHG7、miR-122相關性分析Fig.1 Correlation analysis between SNHG7 and miR-122

圖2 抑制SNHG7對細胞KF增殖、凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibition of SNHG7 on proliferation and apoptosis of KF cells

2.4過表達miR-122對KF細胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-122組KF細胞中miR-122表達顯著升高，CyclinD1、Bcl-2表達顯著降低，P21、Bax表達水平顯著升高，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖4、表3。過表達miR-122可抑制KF細胞增殖，促進其凋亡。

圖3 SNHG7與miR-122的靶向關系Fig.3 Targeting relationship between SNHG7 and miR-122

2.5抑制miR-122表達可逆轉SNHG7對KF細胞增殖、凋亡的作用 與si-NC組相比，si-SNHG7組KF細胞SNHG7表達顯著降低，miR-122表達顯著升高，CyclinD1表達顯著降低，P21表達顯著升高，細胞增殖抑制率顯著升高，Bcl-2表達顯著降低，Bax表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與si-SNHG7+anti-miR-NC組相比，si-SNHG7+anti-miR-122組KF細胞SNHG7表達顯著升高，miR-122表達顯著降低，CyclinD1表達顯著升高，P21表達顯著降低，細胞增殖抑制率顯著降低，Bcl-2表達顯著升高，Bax表達顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖5、表4。抑制miR-122表達可逆轉SNHG7對KF細胞增殖、凋亡的作用。

圖4 過表達miR-122對細胞KF增殖、凋亡的影響Fig.4 Effect of overexpression of miR-122 on proliferation and apoptosis of KF cells

表2 抑制SNHG7對KF細胞增殖、凋亡的影響

表3 過表達miR-122對細胞KF增殖、凋亡的影響

圖5 抑制miR-122表達對SNHG7對KF細胞增殖、凋亡的影響Fig.5 Effect of inhibition of miR-122 expression on SNHG7 for proliferating and apoptosis in KF cells

表4 抑制miR-122表達cf SNHG7對KF細胞增殖的影響

3 討論

瘢痕疙瘩為病理性瘢痕，主要表現為纖維化過度，單獨手術切除復發率較高，且技術要求較高，易引起并發癥，因此，需聯合藥物治療[11]。闡明瘢痕疙瘩的形成機制、探尋相應的致病基因位點可為瘢痕疙瘩的靶向基因治療提供理論依據[12]。研究發現lncRNA參與皮膚病發生發展，與瘢痕疙瘩的發生發展相關[13]。SNHG7在結直腸癌組織中表達上調，促進結直腸細胞系增殖、侵襲和遷移[14]。抑制SNHG7表達可通過下調BDNF抑制甲狀腺癌細胞增殖并誘導其凋亡[15]。SNHG7在膀胱癌組織中高表達，下調SNHG7可抑制惡性膀胱癌[16]。本研究結果顯示，在瘢痕疙瘩組織中SNHG7表達顯著升高，抑制SNHG7表達KF細胞中CyclinD1、Bcl-2表達顯著降低，P21、Bax表達顯著升高，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，說明抑制SNHG7表達可抑制KF細胞增殖，促進細胞凋亡。

miRNA參與瘢痕形成過程，調控轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads信號通路、細胞外基質合成與降解、成纖維細胞增殖與分化和上皮間質轉化(EMT)。研究發現過表達miR-122可促進透明腎細胞癌細胞增殖、侵襲和遷移[17]。miR-122在膠質瘤患者血漿中呈低表達，可作為膠質瘤診斷和預后的生物標志物[18]。miR-122可靶向作用于Runt相關基因2(runt-related gene 2，RUNX2)，促進線粒體凋亡通路激活及神經膠質瘤細胞凋亡[19]。本研究結果顯示，瘢痕疙瘩組織中miR-122表達顯著降低，過表達miR-122的KF細胞中CyclinD1、Bcl-2表達顯著降低，P21、Bax表達顯著升高，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，提示過表達miR-122可抑制KF細胞增殖，促進其凋亡。研究發現，敲低lncRNA HULC可通過上調miR-122抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲，并促進其凋亡[20]。lncRNA DRAIC通過靶向下調miR-122促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移[21]。本研究結果顯示，SNHG7靶向調控miR-122，抑制miR-122表達可逆轉SNHG7對KF細胞增殖和凋亡的促進作用，提示SNHG7可能通過調控miR-122表達影響KF細胞增殖和凋亡。

綜上所述，抑制SNHG7表達可抑制人KF細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與靶向調控miR-122有關，為瘢痕疙瘩的治療提供新思路和新靶點。