滋腎通絡(luò)方功效單元對CIA小鼠CD4+T細胞miRNAs表達的差異調(diào)控作用①

周玲玲 蔣寶平 錢飛亞 申美玉 楊 培 狄昱希 周學平

(南京中醫(yī)藥大學，南京 210023)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以多關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，其發(fā)病率和致殘率較高，能引起關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，嚴重時可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。CD4+輔助性T細胞(helper T cells,Th)是機體適應(yīng)性免疫細胞，可釋放促炎(IFN-γ,IL-6,IL-17)或抗炎(IL-4,IL-10,IL-13)細胞因子，調(diào)控細胞和體液免疫應(yīng)答[1]。其分化異常是RA免疫失衡的主要原因，而其分化的可塑性特點，可能造成RA免疫平衡的反復(fù)擾動[2]。因此，調(diào)控CD4+T細胞分化的動態(tài)平衡對制約RA的發(fā)生發(fā)展起重要作用。

滋腎通絡(luò)方(Zishentongluo Formula，ZTF)由國醫(yī)大師周仲瑛教授臨床經(jīng)驗方(清絡(luò)通痹方)精簡而來，根據(jù)RA基本治則治法，將具有不同功效的生地、雷公藤、青風藤、僵蠶、三七配伍，共奏滋腎養(yǎng)陰、祛風除濕、化痰祛瘀之效。前期研究證實精簡方與原方具有相似的治療效果，且可調(diào)整Th細胞分化平衡，但具體調(diào)節(jié)機制尚不明確[3,4]。

microRNA(miRNA)對CD4+T細胞分化及可塑性具有重要調(diào)控作用，在RA復(fù)雜病機中具有重要價值[5]。項目組前期采用miRNA芯片篩選了RA的miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)RA中存在多種miRNAs表達異常[6,7]。miRNAs表達具有可調(diào)、可逆性，而其調(diào)控CD4+T細胞可塑性分化的多靶點、多環(huán)節(jié)特點為中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)功能的實現(xiàn)提供可能。前期初步的觀察發(fā)現(xiàn)ZTF能夠調(diào)節(jié)RA患者不同部位miRNA的異常表達[8,9]。miRNAs能通過血液和淋巴循環(huán)在不同器官組織間運送并傳遞信息，這可能是RA患者出現(xiàn)全身和局部免疫功能紊亂的重要關(guān)聯(lián)因素[10]。提示ZTF不同功效藥物可能通過差異調(diào)控miRNAs，協(xié)同調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化平衡，改善RA患者的免疫失衡。

項目組前期篩選了可能在RA中調(diào)控CD4+T細胞分化的相關(guān)miRNAs，本研究擬選擇和臨床RA免疫紊亂較為類似的小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型，觀察CIA小鼠CD4+T細胞中相關(guān)miRNAs的表達及ZTF對其的調(diào)控作用；在此基礎(chǔ)上，分別觀察該方的滋腎養(yǎng)陰(YY)、祛風除濕(QF)、化痰祛瘀(HT)3個不同功效單元對上述miRNAs的調(diào)控差異，為進一步解析中醫(yī)整體調(diào)節(jié)治療RA等慢性復(fù)雜疾病的組方規(guī)律提供科學依據(jù)[11]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡SPF級DBA/1雄性小鼠28只，購自南京大學模式動物所，實驗動物合格證：SCXK(蘇)2015-0001，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，人工光照12 h，室溫(23±2)℃，相對濕度：50%～60%。

1.1.2藥品與試劑 ZTF：青風藤、雷公藤、生地黃、炙僵蠶和三七以15∶15∶15∶10∶3比例混合制成水提液，每升含生藥量0.84 kg；滋腎養(yǎng)陰功效單元：生地黃水提液，每升含生藥量0.22 kg；祛風除濕功效單元：青風藤、雷公藤15∶15比例混合制成水提液，每升含生藥量0.43 kg；化痰祛瘀功效單元：炙僵蠶、三七10∶3 混合制成水提液，每升含生藥量0.19 kg；雷公藤多苷片(Tripterygium Glycosides,TG)，江蘇美通制藥有限公司，批號：131114；牛Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen,CⅡ)，美國Chondrex公司，批號170376；完全弗氏佐劑(complete freund′s adjuvant,CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete freund′s adjuvant,IFA)，美國Sigma公司，批號分別為SLBR3877V和SLBP4499V；TRIzol試劑，南京金益柏生物科技有限公司，批號：0606A17；紅細胞裂解液，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20170707；CD4磁珠，美國BD公司，批號：8129931；胎牛血清，美國Gibco公司，批號：10099141；IMagTM緩沖液，美國天旎公司，批號130-091-221。

1.2方法

1.2.1CIA模型的建立、分組及給藥 DBA/1小鼠28只，24只參照文獻[12]建立CIA模型，其余4只作正常對照組。21 d后將模型動物隨機分為模型組、雷公藤多苷組(TG組)(7.5 mg/kg)、滋腎養(yǎng)陰組(2.2 g生藥/kg)、祛風除濕組(4.3 g生藥/kg)、化痰祛瘀組(1.9 g生藥/kg)和全方組(8.4 g生藥/kg)。各組動物灌胃給予相應(yīng)藥物，給藥體積為10 ml/kg，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周。末次給藥1 h后于超凈臺取脾臟，用于分選CD4+T細胞后提取RNA，檢測相關(guān)miRNAs表達。

1.2.2小鼠脾臟CD4+T細胞的分離 分離脾臟單核細胞，計數(shù)(1×107個/50 μl)，加入CD4磁珠，常溫避光孵育30 min，加入1 ml IMagTMBuffer，置于磁力架，靜置10 min，磁力架傾斜45°，移液器貼管壁輕柔吸出液體后再次加入1 ml IMagTMBuffer，混勻后置于磁力架靜置5 min，磁力架傾斜45°，移液器貼管壁吸出液體，重復(fù)2次。

1.2.3RT-qPCR檢測CD4+T細胞中miRNAs表達 TRIzol法提取CD4+T細胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板擴增DNA。擴增體系為：16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，置于冰上待用或-20℃保存。分別檢測目標miRNAs和內(nèi)參(U6)表達情況miRNAs及內(nèi)參引物序列見表1，反應(yīng)體應(yīng)為：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 60 s收集熒光，循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后，95℃ 10 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s繼續(xù)反應(yīng)，并從60℃緩慢加熱到99℃。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，計算目的基因表達量。

2 結(jié)果

2.1CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs表達 結(jié)合前期篩選的結(jié)果和文獻檢索，分析RA異常表達的miRNAs中可能參與CD4+T細胞調(diào)控的有以下8種：Let-7g-5p、miR-10b-5p、miR-27b-3p、miR-146b-5p、miR-10a-3p、miR-26b-5p、miR-143-3p、miR-155-5p。本研究進一步驗證了這8種miRNAs在CD4+T細胞中表達情況。圖1結(jié)果顯示，與正常對照組相比，CIA小鼠CD4+T細胞中上述miRNAs存在上調(diào)或下調(diào)趨勢，其中以Let-7g-5p、miR-10a-3p、miR-26b-5p、miR-143-3p下調(diào)顯著(P<0.01)；miR-27b-3p、miR-155-5p上調(diào)顯著(P<0.05)。

2.2ZTF對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs的調(diào)控作用 圖2結(jié)果顯示，與模型組相比，ZTF小鼠CD4+T細胞中Let-7g-5p、miR-146-5p、miR-26b-5p、miR-143-3p上調(diào)較為顯著(P<0.01)；miR-27b-3p、miR-155-5p下調(diào)較為顯著(P<0.05)。

表1 RT-qPCR引物列表

2.3滋腎養(yǎng)陰功效單元對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs的調(diào)控作用 結(jié)果顯示，與模型組相比，滋腎養(yǎng)陰功效單元小鼠CD4+T細胞Let-7g-5p表達明顯升高(P<0.05)；miR-27b-3p、miR-155-5p表達明顯降低(P<0.05)。見圖3。

2.4祛風除濕功效單元對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs的調(diào)控作用 結(jié)果顯示，與模型組相比，祛風除濕功效單元小鼠CD4+T細胞miR-26b-5p、miR-143-3p表達明顯升高(P<0.05)。見圖4。

2.5化痰祛瘀功效單元對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs的調(diào)控作用 結(jié)果顯示，與模型組相比，化痰祛瘀功效單元小鼠CD4+T細胞miR-26b-5p表達明顯升高(P<0.05)；miR-27b-3p表達明顯降低(P<0.05)。見圖5。

圖1 CIA小鼠CD4+T細胞中miRNAs表達Fig.1 Expressions of miRNAs in CD4+T cells of CIA mice Note:*.P<0.05，**.P<0.01 vs control group.

圖2 ZTF復(fù)方對CIA小鼠CD4+T細胞中miRNAs表達影響Fig.2 Effects of ZTF on expressions of miRNAs in CD4+T cells of CIA miceNote:*.P<0.05，**.P<0.01 vs control group;#.P<0.05，##.P<0.01 vs model group.

圖3 滋腎養(yǎng)陰單元對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs影響Fig.3 Effects of Zishenyangyin unit on differential miRNAs in CD4+T cells of CIA miceNote:*.P<0.05，**.P<0.01 vs model group.

圖4 祛風除濕單元對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs的影響Fig.4 Effects of Qufengchushi unit on differential miRNAs in CD4+T cells of CIA miceNote:*.P<0.05 vs model group.

圖5 化痰祛瘀單元對CIA小鼠CD4+T細胞中差異性miRNAs影響Fig.5 Effects of Huatanquyu unit on differential miRNAs in CD4+T cells of CIA miceNote:*.P<0.05，**.P<0.01 vs model group.

3 討論

miRNAs是大約由22個核苷酸組成的保守非編碼RNA，其調(diào)控作用幾乎涉及包括細胞發(fā)育、活化、增殖、凋亡及中樞和外周免疫耐受在內(nèi)的所有生物學過程，是調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化、功能和可塑性的調(diào)節(jié)劑，其表達和功能改變可導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能障礙并增強對自身免疫疾病的易感性[13,14]。miRNA的調(diào)控作用具有網(wǎng)絡(luò)性特點：單一miRNA通過不同靶點影響分化的不同階段而產(chǎn)生效應(yīng)的協(xié)同；同一miRNA在不同水平調(diào)節(jié)分化的關(guān)鍵信號而產(chǎn)生效應(yīng)的增強；同一關(guān)鍵分子是多個不同miRNA的靶點而產(chǎn)生的效應(yīng)疊加。上述特點提示miRNA在RA復(fù)雜病機中具有重要價值。

項目組前期針對RA患者、大鼠、小鼠外周血循環(huán)miRNAs的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在RA患者、動物和細胞均有類似的下調(diào)/上調(diào)，提示其在RA的異常表達中具有普遍性，結(jié)合文獻分析，部分miRNAs可能對CD4+T細胞的分化和功能起調(diào)節(jié)作用。本研究首先在CIA小鼠的CD4+T細胞中驗證了上述miRNAs的表達情況，發(fā)現(xiàn)其都有類似于外周血的變化趨勢，其中以Let-7g-5p等6個miRNAs的失調(diào)最為顯著，提示上述miRNAs可能在CD4+T細胞的分化和功能起調(diào)控作用。

項目組前期研究發(fā)現(xiàn)ZTF可調(diào)節(jié)CIA小鼠外周血、DRG神經(jīng)節(jié)等不同部位多種miRNAs表達[9]。本研究進一步觀察了ZTF對Th細胞上述miRNAs表達的影響，結(jié)果表明該方能不同程度地逆轉(zhuǎn)CIA小鼠Th細胞中上述miRNAs異常表達，為進一步探索中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)功能的分子機制提供線索。

復(fù)方配伍用藥是中醫(yī)藥治療難治性、復(fù)雜性疾病的優(yōu)勢所在，不同功效藥物通過合理配伍，可從多環(huán)節(jié)、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用，達到標本兼治的效果。RA屬中醫(yī)痹癥范疇，“腎虛絡(luò)痹”為其主要病機，中醫(yī)不同治療方案在“滋腎”或“通絡(luò)”功效上偏重不同，其是否在miRNAs水平也存在調(diào)控差異尚不明確[15]。研究結(jié)果表明，滋腎養(yǎng)陰單元主要影響Let-7g-5p、miR-27b-3p、miR-155-5p表達；祛風除濕單元主要影響miR-26b-5p和miR-143-3p表達；化痰祛瘀單元主要影響miR-26b-5p和miR-27b-3p表達，3個功效單元作用的miRNAs既存在調(diào)控效應(yīng)的疊加，如miR-27b-3p、miR-26b-5p；也存在各自的區(qū)別，如養(yǎng)陰單元作用于Let-7g-5p、祛風單元作用于miR-143-3p。這種調(diào)控位點上的差異可能進一步促使不同功效單元通過靶向不同的miRNAs影響CD4+T細胞的分化、功能和可塑性，發(fā)揮相應(yīng)功效。結(jié)合課題組前期研究，miR-143-3p與關(guān)節(jié)炎疼痛反應(yīng)密切相關(guān)，而祛風除濕單元對關(guān)節(jié)局部疼痛緩解也較為明顯，推測其“通絡(luò)”功效可能與miRNA調(diào)控相關(guān)[9]。研究結(jié)果還提示，對上述多個miRNA的調(diào)控作用均以全方組最為明顯，以上不同功效單元的調(diào)控作用可能產(chǎn)生協(xié)同/增強/疊加效應(yīng)，既可從不同角度改善局部病理狀態(tài)，又可協(xié)同增效促進機體重建新的免疫穩(wěn)態(tài)。進一步研究不同功效單元調(diào)控miRNAs干預(yù)的CD4+T細胞分化和可塑性的相應(yīng)環(huán)節(jié)，可有助于闡釋滋腎養(yǎng)陰、祛風除濕、化痰祛瘀治法方藥的科學內(nèi)涵，為臨床提供更好的治療策略，同時也可能有助于詮釋RA“腎虛絡(luò)痹”的分子生物學基礎(chǔ)。