天麻素保護過氧化氫誘導的神經元氧化損傷的研究①

尹明姬 池永學 李今子

(延邊大學附屬醫院，延吉 133002)

癲癇是一類常見的中樞神經系統疾病，其主要發病表現為大腦海馬區神經元異常電位變化引起短暫的中樞神經功能異常[1]。癲癇的發病受到多種遺傳因素和環境因素的影響，但其深入的致病機制還未闡明[2]。既往研究已經表明，癲癇的發作常常伴隨細胞氧化應激水平的升高，而且在癲癇的病理組織中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平顯著升高，因此氧化損傷與癲癇的發病密切相關[3,4]。

天麻素(gastrodin)是蘭科植物天麻塊根中提取的生物活性物質，很多研究表明天麻素具有抗氧化、抗細胞凋亡、抗炎等功效，被用于癲癇的輔助治療[5,6]。有研究表明天麻素可以通過調控p38/Nrf2信號通路抑制神經細胞SH-SY5Y的凋亡[7,8]，但其在癲癇治療中的具體機制還需要深入研究。本研究通過建立過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷模型，闡釋了天麻素是否通過調控PI3K/AKT信號通路緩解氧化損傷引起的細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1材料 細胞培養所需的DMEM培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒、細胞活性氧探針H2FCAD均購自美國ThermoFisher公司；人超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒購自美國Abcam公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)ELISA試劑盒均購自上海樊克生物技術公司；兔源抗Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)抗體購自美國CST公司(#17366)，鼠源抗p-Akt1/2/3(Thr308)抗體(#sc271964)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG均購自美國SantaCruz公司，天麻素購自美國Sigma公司，過氧化氫溶液購自上海生工公司。人視網膜神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購自中國醫學科學院細胞庫SH-SY5Y細胞。

1.2方法

1.2.1細胞培養及實驗分組 SH-SY5Y細胞培養在含有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。設置對照組、氧化損傷組(H2O2)和天麻素處理組(H2O2+天麻素)，其中對照組細胞在正常條件下培養，氧化損傷組細胞在培養基中加入200 μmol/L過氧化氫(H2O2)，天麻素處理組同時加入200 μmol/L H2O2和10 μmol/L天麻素。

1.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡 SH-SY5Y細胞經過胰酶消化、離心棄上清，用Annexin-V結合緩沖液重懸細胞，并調整細胞密度至1×106個/ml，取100 μl細胞懸液加入5 μl FITC-Annexin-V和1 μl PI，室溫孵育15 min，加400 μl磷酸鹽緩沖液，隨后使用流式細胞儀檢測。

1.2.3流式細胞術檢測細胞ROS水平 SH-SY5Y細胞經胰酶消化、離心后用磷酸鹽緩沖液重懸，清洗1次。隨后加入終濃度1 μmol/L H2DCFDA活細胞ROS指示劑，室溫孵育30 min，隨后離心去除染料，用DMEM培養基重懸細胞，使用流式細胞儀檢測488 nm波長處激發熒光信號。

1.2.4ELISA 胰酶消化、離心并用磷酸鹽緩沖液重懸SH-SY5Y細胞，置于冰上，使用超聲破碎細胞，隨后12 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片，保留上清細胞裂解液。每孔加入100 μl細胞裂解液或標準品加入96孔包被板中，室溫孵育2 h后洗滌3次，后加入酶標試劑100 μl，室溫孵育1 h后洗滌3次，分別加入顯色液避光放置15 min后加入終止液終止顯色。用酶標儀讀取每孔在450 nm的A值，并通過標準曲線計算SOD濃度。

1.2.5蛋白質免疫印跡實驗 細胞裂解液加入5×SDS上樣緩沖液后，100℃沸水浴10 min，得到的蛋白樣品經過SDS-PAGE凝膠電泳分離，并使用濕轉法將蛋白樣品轉移到PVDF膜上，隨后用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，并分別孵育一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗，洗滌3次后加入化學發光底物，在凝膠成像儀下顯影。

2 結果

2.1Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡水平 與對照組相比，H2O2處理細胞8 h、24 h后，SH-SY5Y細胞凋亡水平顯著上升(8 h組：t=5.713，P=0.004 6；24 h組：t=8.77，P=0.000 9)。而H2O2聯合天麻素處理組細胞相較于H2O2處理組細胞凋亡水平顯著下降(8 h組：t=2.883，P=0.044 9；24 h組：t=4.145，P=0.014 3)，見表1。

2.2H2DCFDA染色檢測細胞ROS水平 與對照組相比，H2O2處理顯著提升了細胞內ROS水平(t=15.9，P<0.000 1)，而H2O2聯合天麻素處理后細胞內ROS水平顯著下降(t=7.294，P=0.001 9)，見圖1、表2。

2.3ELISA檢測細胞SOD、MDA、GSH-Px和LDH含量 與對照組相比，H2O2處理引起的氧化損傷導致細胞內SOD表達水平下降(t=5.969，P=0.004)，MDA水平上升(t=6.839，P=0.002 4)，LDH水平上升(t=7.307，P=0.001 9)，GSH-Px水平下降(t=5.775，P=0.004 5)；而H2O2聯合天麻素處理后細胞內SOD表達水平有一定程度的回升(t=3.492，P=0.025 1)，MDA水平下降(t=3.91，P=0.017 4)，LDH水平下降(t=4.105，P=0.014 8)，GSH-Px水平上升(t=4.429，P=0.014)，見表3。

表1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平

圖1 流式細胞術檢測SH-SY5Y細胞內ROS水平Fig.1 ROS levels in SH-SY5Y cells were measured by flow cytometry

表2 流式細胞術檢測各組細胞ROS水平

表3 ELISA檢測各組細胞SOD、MDA、LDH和GSH-Px表達

圖2 Western blot檢測各組細胞AKT、PI3K磷酸化修飾水平Fig.2 Expression of AKT and phosphorylation of PI3K in each group were measured by Western blotNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

2.4蛋白質免疫印跡實驗檢測PI3K/AKT信號通路 與對照組相比，H2O2處理引起的氧化損傷的細胞中，磷酸化AKT(p-AKT，分子量約60 kD)蛋白表達水平下降(t=25.1，P<0.000 1)，磷酸化PI3K(p-PI3K，分子量約80 kD)表達水平下降(t=39.35，P<0.000 1)；相較于H2O2單獨處理組，H2O2聯合天麻素處理組細胞p-AKT表達水平回升(t=3.905，P=0.017 5)，p-PI3K水平回升(t=4.11，P=0.0147)。

3 討論

天麻素在癲癇治療中的作用早有報道，并已經作為輔助藥物應用于癲癇的臨床治療之中，然而天麻素作用于神經細胞的分子機制還缺少深入研究。本研究發現了天麻素在過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞的氧化損傷中能夠發揮保護作用，抑制過氧化氫誘導的細胞凋亡。過氧化氫處理的細胞會產生大量自由基，進而引起細胞的氧化應激損傷和細胞凋亡。在癲癇的發病過程中通常會伴隨著ROS升高導致的神經細胞的氧化損傷[3]。細胞內高水平的ROS可以引發細胞的氧化應激，使細胞內蛋白氧化失活、DNA損傷以及線粒體等細胞器的功能紊亂[9]。過去的一些研究已經利用動物模型實驗驗證了天麻素的在治療神經系統相關疾病中的作用，如在戊四唑誘導的小鼠驚厥模型中，天麻素可以抑制模型動物大腦中相關炎癥因子如IL-1β、TNF-α等的表達，并緩解小鼠癥狀[10]。此外，天麻素還被發現能夠抑制α-突觸核蛋白以及β淀粉樣蛋白在神經元中的積累，對神經退行性疾病如阿茲海默氏癥、帕金森癥中具有一定的治療作用[11,12]。

本研究發現，天麻素處理的SH-SY5Y細胞可以通過上調SOD和GSH-Px的表達幫助細胞清除自由基，降低細胞內的ROS水平，但天麻素是如何調控SOD和GSH-Px的表達還需要深入的研究。

本研究還發現天麻素能夠激活氧化損傷細胞的PI3K/AKT信號通路。PI3K/AKT是調控細胞活性的重要信號通路，PI3K的磷酸化引發下游AKT蛋白的激活，進而影響細胞有絲分裂，促進細胞的增殖活性[13]。FoxO3是細胞響應氧化應激的一個重要轉錄因子，在活性氧刺激的細胞中，FoxO3發生磷酸化從胞漿轉運到細胞核中，并調控包括SOD在內的多種靶基因的轉錄，進而影響細胞的氧化應激[14,15]。在神經干細胞中，激活的AKT能夠磷酸化FoxO3，并促進其向細胞核轉運[16]。因此可以推測，在本研究所使用的過氧化氫誘導的SH-SY5Y的氧化損傷模型中，天麻素很可能通過PI3K/AKT信號通路激活FoxO3并上調SOD表達，清除細胞內活性氧，抑制細胞凋亡。最近有研究表明，炎癥反應在癲癇發病過程中也發揮了重要作用，而神經元細胞的氧化損傷也是激活神經系統免疫反應的主要因素之一[17]。天麻素是否能夠通過對免疫反應的調控影響癲癇的疾病進展還需深入探討。