去甲斑蝥素通過調控miR-182-5p抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲①

楊瑞英 張翠亞 衛海寧 李鵬哲 閆宇華 侯風敏

(邢臺市人民醫院婦產科，邢臺 054001)

卵巢癌是一種常見的婦科腫瘤，其惡性程度高且對放化療不敏感[1]。臨床治療以手術為主，但患者整體預后較差[2]。去甲斑蝥素(norcantharidin,ND)由斑蝥素衍生而來，為斜方形鱗狀晶體，難溶于水，易溶于丙酮和醋酸乙酯[3]。臨床上用于治療肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、結腸癌等[4]。有文獻報道ND對肝癌、食管鱗癌等細胞株的形態、增殖有破壞或抑制作用，可提高癌細胞呼吸控制率及溶酶體酶活性，干擾癌細胞分裂，抑制其DNA合成[5]。

現有研究表明，miRNA和LKB1/AMPK在多種惡性腫瘤組織中均有表達，在腫瘤細胞凋亡、轉移和侵襲過程中均發揮重要作用[6]。但miRNA和LKB1/AMPK在卵巢癌中的作用鮮有報道，ND對卵巢癌的作用如何，其是否可通過miRNA和LKB1/AMPK在卵巢癌治療過程中發揮作用尚未明確。因此本研究以卵巢癌SKOV3細胞為研究對象，探討ND對卵巢癌增殖和遷移的作用及其對miRNA和LKB1/AMPK的作用，以期為ND在臨床上治療卵巢癌提供可靠的實驗依據和藥物靶點。

1 材料與方法

1.1材料 SKOV3細胞購自中科院上海細胞庫；si-miR-182-5p由上海吉凱公司提供；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細胞裂解液、結晶紫均購自武漢天根生物有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司；DMEM培養基、優級胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國 HyClone；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛購自北京碧云天有限公司；p-LKB1、p-AMPK、p65及E-cadhrein、Vimentin、Snail抗體和兔二抗購自英國 Abcam；ECL化學發光試劑盒購自美國 Advansta；Transwell小室購自康寧公司；LipofectaminTM2000(Carlsbad,CA)購自Invitrogen。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細胞增殖 選取對數生長期細胞以4×105個/孔鋪于96孔板。丙酮溶解ND(IC50值為45 μmol/L)，PBS稀釋至不同濃度(10、20、30和 40 μmol /L)，37℃，5% CO2培養箱內培養1～4 d。結束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。檢測細胞CCK-8混合液A450值并分析。

1.2.2Transwell細胞侵襲 BD膠和培養液1∶9配制，冰上操作，于37℃細胞培養箱孵育5 h，37℃細胞培養箱內水化基底膜 30 min。胰蛋白酶消化對數生長期細胞，計數，5×104個/孔，Transwell小室下室加入培養于10%胎牛血清DMEM 培養液600 μl，上室加入200 μl無血清細胞懸液，接種至 24 孔板。16 h后PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，室溫風干。0.1%結晶紫染色15 min，PBS洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移細胞，33%乙酸脫色，讀取A570值并分析。

1.2.3qRT-PCR檢測mRNA表達 TRIzol法提取總RNA，RNA逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為性質穩定的cDNA。qRT-PCR檢測目的基因相對β-actin表達水平。反應條件設定如下：95℃預變性10 min；95℃ 10 s;60℃ 20 s；72℃延伸35 s。2-ΔΔCt法計算目的基因相對mRNA表達。引物序列如表1。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 調整細胞數5×104個/ml，80%細胞密度時收集細胞。ND給藥12 h后， 給藥組SKOV3細胞加入外源性LKB1/AMPK信號通路激動劑GSK621 2 ng/ml以驗證ND是否通過LKB1/AMPK信號通路抑制EMT。PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解，30 min后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后轉膜，轉膜成功后脫脂牛奶封閉2 h，PBST清洗，1∶1 000 稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，發光拍照。

表1 引物序列

1.2.5細胞轉染沉默miR-182-35p表達 將細胞隨機分配至不同組(3×105個/組)，以si-miR-182-35p和相應陰性對照(miR-NC)轉染。轉染前24 h將細胞接種于6孔板，融合至30～40%。每次轉染使用si-miR-182-35p和miR-NC各20 nmol/L。

2 結果

2.1ND抑制SKOV3細胞增殖和侵襲 CCK-8結果顯示10、20、30、40 μmol /L ND對SKOV3細胞增殖抑制作用均增強(P<0.05)，且30 μmol /L抑制作用最強(圖1A)。Transwell結果表明30 μmol/L的ND顯著抑制SKOV3細胞侵襲作用(P<0.05，圖1B)。

2.2ND抑制LKB1/AMPK信號通路并調控EMT相關蛋白表達 qRT-PCR和Western blot結果發現，與對照組相比，ND顯著抑制LKB1/AMPK通路相關蛋白p-LKB1、p-AMPK和p-p65表達(P<0.05)，同時上調EMT相關蛋白E-cadhrein，下調Vimentin和Snail(P<0.05)，GSK621可以部分抵消ND對LKB1/AMPK信號通路和EMT的抑制作用(P<0.05，圖2)。

2.3GSK621部分抵消ND抑制SKOV3細胞增殖和侵襲作用 結果顯示加入GSK621后，ND對SKOV3細胞增殖和侵襲抑制作用減弱(P<0.05，圖3)，但依舊強于陰性對照組，提示GSK621可挽回ND對SKOV3細胞增殖和侵襲的抑制作用。

圖1 ND對SKOV3細胞增殖和侵襲影響Fig.1 Effect of ND on proliferation invasion of SKOV3 cellsNote:A.Proliferation;B.Invasion.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖2 LKB1/AMPK和EMT相關蛋白表達Fig.2 Expressions of LKB1/AMPK and EMT-related proteinsNote:A.qRT-PCR;B.Western blot.*.P<0.01；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.4ND抑制miR-182-5p表達 qRT-PCR檢測ND給藥后SKOV3細胞內miR-182-5p的表達，結果發現與對照組相比，ND顯著抑制miR-182-5p表達(P<0.05，圖4)。

圖4 ND對miR-182-5p表達影響Fig.4 Effect of ND on miR-182-5p expressionNote:***.P<0.001.

圖5 qRT-PCR驗證si-miR-182-5p轉染作用Fig.5 qRT-PCR validates si-miR-182-5p transfectionNote:***.P<0.001.

2.5ND通過調控miR-182-5p抑制LKB1/AMPK信號通路 si-miR-182-5p轉染SKOV3細胞后，miR-182-5p的表達顯著降低(P<0.05，圖5)；p-LKB1、p-AMPK和p-p65表達隨miR-182-5p沉默而降低(P<0.05)，同時E-cadhrein上調，Vimentin和Snail下調(P<0.05，圖6)。

2.6miR-182-5p促進SKOV3細胞增殖和侵襲CCK-8和Transwell分別檢測si-miR-182-5p SKOV3細胞增殖和侵襲，發現與正常對照組相比，SKOV3細胞增殖和侵襲能力隨miR-182-5p表達降低而顯著增強(P<0.05，圖7)。

圖6 si-RNA轉染后LKB1/AMPK和EMT相關蛋白表達Fig.6 LKB1/AMPK and EMT-related protein expression after siRNA transfectionNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

圖7 si-miR-182-5p抑制SKOV3細胞增殖及侵襲Fig.7 si-miR-182-5p inhibits proliferation and invasion of SKOV3 cellsNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

3 討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌，死亡率位于各類婦科腫瘤首位[7]。由于卵巢位于盆腔內，且缺乏典型臨床癥狀，因此很難被發現。卵巢癌的發病機制目前不甚明確，臨床上主要采用手術療法[8]。傳統中醫藥斑蝥的提取物斑蝥素對肝癌和肺癌等具有一定的治療作用，而ND是斑蝥素的合成衍生物，現有研究表明其對多種腫瘤的治療作用強于斑蝥素[9]。但ND對卵巢癌的作用及分子機制尚不明確。本研究以SKOV3細胞為研究對象，觀察ND對其作用和具體分子機制。

本研究探討ND對SKOV3細胞增殖影響，確定ND對卵巢癌細胞最佳作用濃度，結果發現30 μmol /L ND顯著抑制SKOV3細胞增殖，臨床上ND給藥劑量為成人5～15 mg/次，3次/d，由小劑量逐漸增量，癌癥晚期患者可用較高劑量，但沒有較為精準的給藥劑量。通過體外藥物濃度篩選，可初步為臨床癌癥患者給藥劑量提供實驗依據。為了研究ND對SKOV3細胞侵襲作用影響，Transwell小室檢測給藥前后SKOV3細胞侵襲能力變化，結果發現30 μmol/L ND可顯著抑制SKOV3細胞侵襲。提示ND對SKOV3細胞的惡性生物學行為具有抑制作用，但機制尚未明確。

有研究報道LKB1/AMPK信號通路在結腸癌、胃癌和肺癌中被激活，主要通過磷酸化LKB1和AMPK促進p65磷酸化，從而調控EMT相關蛋白表達[10]。ND在卵巢癌LKB1/AMPK信號通路是否發揮同樣作用目前尚不明確。Western blot檢測ND給藥前后SKOV3細胞LKB1/AMPK信號通路蛋白p-LKB1、p-AMPK及p-p65表達，qRT-PCR和Western blot檢測ND給藥前后SKOV3細胞EMT相關蛋白表達，結果發現ND顯著抑制LKB1/AMPK信號通路蛋白磷酸化同時抑制EMT相關蛋白Vimentin和Snail表達。挽回實驗表明，GSK621可以部分抵消ND對LKB1/AMPK信號通路和EMT抑制作用，同時消除ND對SKOV3細胞增殖和侵襲的抑制作用。說明ND可能通過LKB1/AMPK信號通路抑制SKOV3細胞EMT發生。

文獻指出miRNA與LKB1/AMPK信號通路在腫瘤中關系密切，而miR-182-5p作為一個促癌因素在多種腫瘤中均有所報道，但在卵巢癌中的相關研究較少[11,12]。本研究假設ND通過抑制miR-182-5p影響LKB1/AMPK信號通路從而激活EMT發生導致卵巢癌細胞增殖和侵襲。為驗證該假設，qRT-PCR檢測ND給藥前后miR-182-5p在SKOV3細胞中表達，結果表明ND顯著抑制miR-182-5p表達，提示ND對miR-182-5p具有抑制作用，為下一步研究奠定基礎。miR-182-5p對SKOV3細胞的影響研究表明其可以促進SKOV3細胞的增殖和侵襲。siRNA轉染技術沉默miR-182-5p在SKOV3細胞中表達，Western blot檢測轉染前后LKB1/AMPK信號通路蛋白p-LKB1、p-AMPK和p-p65表達及EMT相關蛋白E-cadhrein、Vimentin和Snail表達變化，結果發現p-LKB1-p-AMPK的磷酸化和p-p65表達隨miR-182-5p沉默而降低，同時上調E-cadhrein下調Vimentin和Snail。提示ND可能通過抑制miR-182-5p阻滯LKB1/AMPK信號通路和EMT發生。但本研究主要集中于體外研究，ND對卵巢癌影響的體內研究將是課題組下一步的主要工作。