利用CRISPR/Cas9技術構建Fbxw7敲低的Raw264.7穩定細胞株及其生理功能檢測①

宋璟瑞 周 爽 聞 馨 陳云飛 萬 梅 羅梁杰 杜德兵 王德成

(三峽大學醫學院，三峽大學感染與炎癥損傷研究所，宜昌 443002)

Fbxw7(F-box and WD repeat domain containing 7)，是SCF型(Skp1-Cullin-F-box protein)泛素連接酶E3的底物識別蛋白[1,2]。Fbxw7 能夠通過特異性識別并結合底物蛋白，從而使目的蛋白通過泛素蛋白酶系統降解。大量研究發現，Fbxw7 不僅靶向泛素化降解多種參與腫瘤發生發展的蛋白分子，如Notch、Myc、Jun、Cyclin E，還在脂類代謝，細胞增殖和分化，維持干細胞的穩態中發揮重要作用[1,3-5]。同時，最新研究證實RNA病毒感染過程中，E3泛素連接酶Fbxw7通過保持維甲酸誘導Ⅰ型基因(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的穩定性，正向調控Ⅰ型干擾素的產生，最終促進機體抗RNA病毒的天然免疫應答[6]。

Fbxw7表達量的改變會導致下游底物發生級聯反應,并在疾病發生發展過程中扮演重要角色[7]。目前關于Fbxw7參與疾病的發生與發展的具體機制尚不完全清楚[7-9]。但有研究結果證實Fbxw7基因敲除小鼠會導致發育缺陷和胚胎致死[10]。所以通過建立過表達或者低表達Fbxw7的穩定細胞系，可為進一步研究Fbxw7的功能與作用機制提供新的平臺。本研究利用近年來在古細菌中發現的成簇的有規律間隔織的短回文重復序列CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9) 技術成功構建了Raw264.7巨噬細胞中Fbxw7基因敲低穩定細胞株,并檢測Fbxw7_Cas9KO質粒轉染后Raw264.7細胞中Fbxw7的mRNA和蛋白表達變化，最后從細胞增殖、凋亡等方面初步探索Fbxw7在Raw264.7細胞的生長分化中的作用,為深入研究Fbxw7在巨噬細胞中的功能和機制提供相應理論數據。

1 材料與方法

1.1材料 Raw264.7(小鼠腹腔巨噬細胞)與293ft(人胚腎細胞)均購自中國科學院干細胞庫。Control CRISPR/Cas9質粒、Fbxw7_CRISPR/Cas9KO 及其HDR質粒，質粒專用培養基均購自Santa Cruz公司。Thermo Turbofect轉染試劑購自ThermoFisher Scientific。嘌呤霉素培養基購自Solarbio公司。胰酶消化液(Gelife Science)。引物由AuGCT DNA-SYN合成。Anti-Fbxw7抗體(ab109617)購自Abcam公司。β-actin抗體、HRP-羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒均購自博士德生物有限公司。cDNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量SYBR染料試劑盒購自Vazyme Biotech。Cy3標記羊抗小鼠IgG、FITC標記羊抗兔IgG、DAPI、ECL化學發光試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司。CCK-8試劑盒均購自博士德生物有限公司。凋亡試劑盒均購自BD生物公司。

1.2方法

1.2.1Cas9轉染效率優化 ①為優化轉染試劑Turbofect與Cas9 質粒的最佳比例，分別以不同體積/濃度比(5 μl∶1 μg；10 μl∶1 μg；15 μl∶1 μg)將Turbofect與Control Cas9 質粒進行轉染。②在6孔細胞培養板(Corning)接種2×105個293FT細胞，置于細胞培養箱中培養24 h。③分別將不同濃度的轉染試劑稀釋到質粒專用培養基中，最終體積為150 μl，混勻后室溫靜置5 min；質粒DNA稀釋到質粒專用培養基中，最終體積達到150 μl，混勻后室溫靜置5 min。④將質粒DNA溶液直接滴加稀釋后的轉染試劑的試管中，立即漩渦混勻，并在室溫靜置20 min以上。⑤轉染之前，用新鮮無抗生素培養基更換6孔板的培養液，質粒DNA/添加轉染試劑復合物逐滴到培養板中。⑥轉染后24 h內無需更換培養基。⑦轉染48 h后通過熒光顯微鏡檢測紅色熒光蛋白(red fluorescence protein,RFP)觀察，確認Control Cas9 質粒的轉染效率。實驗重復3次。

1.2.2Fbxw7_Cas9 KO質粒和Fbxw7 _HDR質粒共轉染至Raw264.7細胞 ①在6孔培養板(Corning)接種2×105個Raw264.7細胞，在細胞培養箱中培養24 h。②按照轉染試劑體積與Fbxw7_Cas9KO質粒的最佳比例10 μl∶1 μg轉染。③Fbxw7_Cas9KO質粒和Fbxw7_HDR質粒稀釋到質粒專用培養基，最終體積達到150 μl，混勻，室溫靜置5 min。20 μl轉染試劑稀釋到質粒專用培養基，最終體積達到150 μl混勻，室溫靜置5 min。④將Fbxw7_Cas9KO質粒溶液直接滴加稀釋后的轉染試劑的試管中，立即漩渦并在室溫靜置20 min以上。⑤轉染之前，用新鮮無抗生素的培養基更換6孔板的培養液，300 μl質粒DNA/添加轉染試劑復合劑逐滴到培養板中。⑥轉染24 h之后，根據其需要更換培養基。⑦通過熒光顯微鏡檢測RFP表達，以確認Fbxw7Cas9 KO質粒和Fbxw7 HDR質粒共轉染成功。

表1 實時定量熒光PCR引物序列

1.2.3嘌呤霉素篩選Fbxw7_Cas9KO質粒和Fbxw7_HDR質粒共轉染成功的Raw264.7 ①經過篩選Raw264.7中使用嘌呤霉素最佳濃度為1 μg/ml。②使用含嘌呤霉素含血清的選擇性培養基，在7 d內選擇殺死100%未轉染細胞。③轉染48 h后，吸出培養基并用含有適當濃度的嘌呤霉素的新鮮培養基將其替換。④嘌呤霉素培養基中連續培養7 d。大約每2 d，用新鮮選擇性培養基吸出并替換。

1.2.4挑選Fbxw7_Cas9KO質粒成功轉染的單克隆細胞 ①通過胰蛋白酶消化分離細胞，并通過0.4 μm細胞濾網將細胞團破碎成單個細胞。用血細胞計數器定量測量勻漿細胞溶液中的細胞濃度。②將細胞從均質化的細胞溶液轉移至條件培養基中，用新鮮的完全培養基制成5個/ml的新細胞溶液，播種到96孔板每孔約10 μl該細胞溶液。④將生長成細胞集落的細胞用胰酶消化后傳代，培養后凍存。

1.2.5實時定量PCR檢測Fbxw7的mRNA表達水平 ①將正常Raw264.7細胞和Fbxw7突變的Raw264.7細胞鋪于6孔板。②Trizol法提取總RNA。首先用Trizol試劑裂解細胞，靜置5 min離心，取上清液再加入等量氯仿，充分振蕩后冰上靜置5 min，離心后加等量的異丙醇，冰上靜置20 min后，離心棄上清，加70%無水乙醇洗滌沉淀，離心棄上清后加入DEPC水20 μl。③RNA經PCR擴增后生成單鏈cDNA。④SYBR Green master Rox用于實時熒光定量PCR，重復實驗3次。

1.2.6Western blot檢測Fbxw7蛋白表達變化

(1)提取正常Raw264.7細胞和Fbxw7突變的Raw264.7細胞的總蛋白：① 用PBS收取細胞，低速離心細胞獲得細胞沉淀，用RIPA 100 μl裂解細胞，冰上靜置50 min，離心取上清液。② 使用BCA蛋白測定試劑盒定量，將96孔板置于37℃恒溫孵育箱中孵育30 min，使用全波長酶標儀在562 nm處測量每孔OD值，根據蛋白標準曲線計算樣本蛋白質濃度。③ 20 μg蛋白置于1.5 ml EP管中，加入1/5總體積的5×SDS上樣緩沖液，100℃沸水浴煮10 min 滅活蛋白，置于-80℃冰箱保存備用。(2)Western blot實驗過程：10%SDS濃縮膠電泳；使用PVDF膜，200 mA恒流轉膜2 h；10%牛奶封閉1.5 h；一抗孵育過夜；二抗孵育1 h；ECL化學發光成像系統中顯影，使用Image J軟件分析目的蛋白條帶表達強度，重復實驗3次。

1.2.7測序分析基因突變位點 ①提取正常Raw264.7細胞和Fbxw7突變的Raw264.7細胞的基因組DNA。② PCR擴增體系如下：2×SYBR Green Taq Mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 10.5 μl，擴增程序為：95℃預變性25 min,95℃變性10 s;54℃退火30 s;72℃延伸40 s;35個循環,最后72℃延伸5 min。③ PCR產物經電泳檢測確定有目標條帶后，回收凝膠純化后送于測序公司進行測序分析。④測序結果采用SnapGene軟件進行序列比對，分析突變位點。

1.2.8Confocal熒光顯微鏡觀察Fbxw7表達 ①將5×105個的正常Raw264.7細胞和Fbxw7突變的Raw264.7細胞分別鋪在6孔板的玻璃蓋玻片上。② 將細胞在4℃下用2%多聚甲醛固定30 min，用0.1%Triton X-100透化，用PBS中的1%BSA封閉1 h，并用兔抗Fbxw7抗體孵育過夜，染色的FITC標記的抗兔第二抗體，以檢測Fbxw7表達位置。用DAPI對細胞核染色。③ 用Leica TCS SP2共聚焦激光顯微鏡檢測表達位置變化，重復實驗3次。

1.2.9細胞活力測定 ①用正常Raw264.7細胞和Fbxw7突變的Raw264.7細胞鋪在96孔板上。② 收集對數期細胞，96孔板每孔加入100 μl對數期細胞，使待測細胞密度至1×103～1×104個/孔；5%CO2、37℃培養箱里孵育24 h。③ 每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞孵育箱繼續孵育2 h。④ 使用全波長酶標儀在450 nm測定吸光度；實驗重復3次。

1.2.10流式細胞術檢測凋亡率 ①用正常Raw264.7細胞和Fbxw7突變的Raw264.7細胞常規培養24 h后收集各孔上清液于離心管中備用。② 將各組細胞用 PBS清洗2次,胰酶消化后與上述上清液共同制成單細胞懸液。③ 離心后，去上清用100 μl的1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl 7-AAD和2.5 μl PE溶液混勻,室溫避光孵育 15 min。④ 加入 400 μl的2×Binding Buffer混勻。⑤ 流式細胞儀進行檢測，重復實驗3次。

2 結果

2.1CRISPR/Cas9 質粒轉染最佳效率 不同條件轉染48 h后，熒光顯微鏡觀察不同視野下RFP表達情況，結果發現在Turbofect與Control CRISPR/Cas9為10 μl∶1 μg時RFP表達最強，表明10 μl∶1 μg為本實驗中Cas9質粒最優轉染條件，見圖1。

2.2Fbxw7_Cas9KO質粒 和Fbxw7_HDR質粒共轉染效率鑒定 確定Turbofect與Cas9質粒的最優轉染條件后，將Fbxw7_Cas9 KO和Fbxw7_HDR質粒共轉染至Raw264.7巨噬細胞。轉染后48 h時用倒置熒光顯微鏡觀察，發現細胞內有RFP的表達與分布，見圖2。

2.3Fbxw7 _ Cas9KO轉染成功后的單克隆挑選及Fbxw7表達檢測 Quantitative Real-time PCR結果顯示,與對照組相比,Fbxw7敲低組的Raw264.7細胞的Fbxw7 mRNA表達明顯下降 (P<0.05,圖3A)。Western blot檢測Fbxw7蛋白表達，結果顯示：與正常Raw264.7細胞相比，Fbxw7敲低組Raw264.7細胞的Fbxw7蛋白表達明顯下降(P<0.01,圖3B、C)。證實Raw264.7細胞的Fbxw7基因已成功被敲低。

2.4基因測序分析 測序結果(圖4B)與原序列進

圖1 Turbofect 與Control CRISPR/Cas9質粒轉染效率 (W：白光；RFP:紅光)Fig.1 Optimal efficiency between Turbofect and Control CRISPR/Cas9 plasmid (W:white light channel;RFP:red light channel)

圖2 Fbxw7-Cas9KO轉染Raw264.7細胞后48 h后RFP檢測Fig.2 Detection of RFP of Raw264.7 cells after 48 h transferred with Fbxw7-Cas9KO plasmid

行對比(圖4A),結果顯示，圖4B紅色框所示原序列與Fbxw7敲低組相比，敲低Fbxw7后的細胞存在多個位點的堿基突變和缺失。

2.5Confocal顯微鏡觀察比較Fbxw7蛋白表達情況 激光共焦距顯微鏡下觀察，發現正常Raw264.7細胞中可檢測到明顯的Fbxw7蛋白表達，且Fbxw7主要分布在細胞核；而Fbxw7敲低組Raw264.7中Fbxw7蛋白表達顯著降低，見圖5。

圖3 Fbxw7 Cas9KO質粒轉染后Raw264.7細胞中Fbxw7的表達Fig.3 Expressions of Fbxw7 in Raw264.7 cell after Fbxw7 Cas9KO plasmid transinfectedNote:*.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 Fbxw7敲低的細胞與正常Raw264.7細胞基因測序結果Fig.4 Comparison of sequencing data of Fbxw7 gene in normal and Fbxw7-knockdown Raw264.7 cells Note:A.Fbxw7 gene sequencing results for normal Raw264.7 cells；B.Fbxw7 gene sequencing results for knocked down in Raw264.7 cells.

圖5 Confocal觀察Fbxw7蛋白的表達變化Fig.5 Examination of expression of Fbxw7 protein with Confocal microscope

圖6 敲低Fbxw7后Raw264.7的細胞增殖能力分析Fig.6 Raw264.7 cell viability was decreased after Fbxw7 knockdownNote:*.P<0.05；**.P<0.01.

2.6Fbxw7對Raw264.7細胞增殖能力的影響 與對照組相比，敲低Fbxw7的Raw264.7的細胞增殖能力明顯下降，并且與正常Raw264.7細胞相比差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，見圖6。

2.7Fbxw7對Raw264.7細胞凋亡能力的影響 流式細胞術及AnnexinV-FITC/PI染色法檢測Raw264.7細胞24 h內凋亡情況。結果顯示,與對照Raw264.7細胞組相比,Fbxw7基因敲低組的Raw264.7細胞凋亡率增加(P<0.05)，見圖7。

圖7 敲低Fbxw7后Raw264.7細胞的凋亡能力分析Fig.7 Apoptosis assay of Raw264.7 cells after Fbxw7 knockdownNote:*.P<0.05.

3 討論

Fbxw7是重要的E3連接酶之一，在過去的十年中，大量研究已證實，E3連接酶Fbxw7在腫瘤發生和發展、細胞增殖、分化和血管生成中起著關鍵作用[1,3-5,11]。Fbxw7通過識別和作用于多個底物分子如c-Myc，cyclin E和MCL-1等參與細胞周期進程，進而參與腫瘤發生和發展[4]。Fbxw7作為腫瘤抑制因子，可調控致癌基因的表達水平，因此近年來越來越多的研究將Fbxw7作為腫瘤預后指標，視為腫瘤治療的潛在靶標[11-13]。研究證實缺失Fbxw7會促進非小細胞肺癌的發生發展并導致吉非替尼耐藥性[14]；骨髓細胞中缺乏Fbxw7會導致細胞凋亡減少，促進自身抗體產生和引起腎小球腎炎等[13]；Fbxw7基因的靶向失活還會導致妊娠中期胚胎的高致死率和嚴重的生長遲緩[10,13,15]。不僅如此，Fbxw7在抗病毒免疫中也發揮重要作用，有研究發現組織特異性敲除的Fbxw7小鼠顯示出對RNA病毒感染的高敏感性，并且病毒復制顯著增強，該研究為Fbxw7在抗病毒免疫中的功能及其相關的臨床意義提供了依據[15]。總之，FBXW7在眾多生物學過程中發揮關鍵作用。

近年來，CRISPR/Cas9系統已被廣泛應用于各種基因功能的研究。CRISPR/Cas9系統是一種在gRNA的指導下，在基因組水平上對目的基因DNA序列進行改造的定點編輯技術，轉染效率穩定[16,17]。目前已有文獻指出，使用CRISPR/Cas9技術可以突變Raw264.7中的內源性miR-155基因，并獲得了miR-155基因組敲除克隆[18]。以上研究結果為利用CRISPR/Cas9技術突變Raw264.7中的相關靶基因及進一步研究這些基因的功能提供了理論基礎與技術手段。

由于CRISPR/Cas9系統存在一定的脫靶率[19]。為了減少脫靶效應，本研究選擇了Fbxw7_Cas9KO質粒和Fbxw7_HDR質粒的共轉染，Fbxw7_HDR質粒的設計是通過非同源端連接(NHEJ)或同源定位(HDR)途徑，修復CRISPR/Cas9系統中產生的含有雙鏈斷裂(DSB)的DNA，從而達到敲低Fbxw7基因的目的。通過實驗結果顯示,利用CRISPR/Cas9技術可以實現Fbxw7基因在Raw264.7細胞穩定低表達,所篩選出的穩定轉染細胞株可用于后續細胞水平的實驗研究。

本研究通過CRISPR/Cas9技術構建了Fbxw7敲低的Raw264.7穩定細胞株，并對敲低Fbxw7后Raw264.7細胞增殖及凋亡的變化做了進一步探索，發現敲低Fbxw7后Raw264.7的增殖能力明顯下降，并且這種下降趨勢可能是Fbxw7表達降低后促進其凋亡導致，這為深入研究Fbxw7在巨噬細胞中的功能和作用機制提供新的線索與工作基礎。