TYK2基因在類風濕關節炎中的表達及作用研究

鄭顯良 姚中吉

(海南醫學院第二附屬醫院輸血科，海口 570311)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是以持續性滑膜炎為主要病理特征的慢性系統性自身免疫疾病，致殘率較高。我國RA患病率約為0.42%，略高于國外報道的發展中國家的0.35%，其中女性發病率約為男性的3倍[1-3]。據報道，RA 50%的發病風險歸因于遺傳因素[4]。RA發病機制復雜，多種免疫細胞的激活和炎癥因子的表達在RA的發病過程中起重要作用[5]。酪氨酸激酶2(TYK2)是JAKs家族成員，可與STATs結合啟動相關基因轉錄、翻譯，促進炎癥因子釋放[6]。目前，國內外關于TYK2基因在系統性紅斑狼瘡、過敏性哮喘、銀屑病等免疫性疾病的作用已開展相關研究，而其在RA中的研究鮮有報道[7-9]。因此，本研究探討TYK2 mRNA在RA患者中的表達，同時檢測RA患者外周血清RA標志物、炎癥因子及骨代謝指標水平，并對其進行相關性分析，明確TYK2基因在RA的作用及機制。

1 資料與方法

1.1資料 選擇2017年6月～2018年10月于我院就診的RA患者55例，其中男性13例，女性42例，年齡23～67歲，病情活動指標簡化疾病活動指數(SDAI)評分7.5～43分，平均(22.34±9.23)分。所有RA患者均符合2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯盟制定的分類標準。健康志愿者50例作為對照，其中男性12例、女性38例，年齡25～60歲，兩組性別、年齡具有可比性。本研究通過我院倫理委員會批準，研究對象或家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1外周血單核細胞分選 EDTA抗凝管抽取RA患者及健康志愿者外周血5 ml，利用人全血單核細胞分離液進行分選，血細胞分析儀進行細胞計數及單核細胞純度檢測。

1.2.2一般指標檢測 分別采集RA患者和健康志愿者外周血3 ml，檢測RF、抗CCP水平，ELISA檢測IL-2、IL-17、IL-21、OST、25(OH)D、β-CTX、T-P1NP水平。

1.2.3TYK2基因檢測 采用RT-PCR法測定RA患者和健康志愿者外周血單核細胞中TYK2基因。TRIzol試劑盒提取樣本總RNA，逆轉錄為cDNA，以GAPDH為內參，采用SYBR Green相對定量法進行定量檢測。引物序列：TYK2 F：5′-GGAGGAGGGTTCTAGTGGCA-3′，R：5′-ATGTCCCGGAAGTCACAG-AAG-3′；GAPDH F：5′-ACAACTTTGGTATCGTG-GAAGG-3′，R：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。反應條件：預變性95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，35～40個循環；溶解曲線分析95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。2-ΔΔCt法定量分析。

2 結果

2.1RA患者和健康志愿者臨床數據比較 50例RA患者外周血清中RF[(129.86±44.10)IU/ml]和抗CCP滴度[(90.17±19.33)RU/ml]顯著高于55例健康志愿者外周血清中RF[(4.35±2.29)IU/ml]和抗CCP滴度[(21.27±5.82)RU/ml](P<0.01)。

2.2RA患者和健康志愿者外周血清炎癥因子水平 RA患者血清炎癥因子IL-2、IL-17、IL-21水平較健康志愿者明顯升高(P<0.01)，見圖1。

2.3RA患者和健康志愿者骨代謝指標比較 RA患者血清OST、25(OH)D、T-P1NP等骨代謝指標水平較健康志愿者均明顯下降，β-CTX水平明顯升高(P<0.01)，見表1。

2.4RA患者和健康志愿者外周血單核細胞TYK2 mRNA表達比較 與健康志愿者(1.60±0.42)相比，RA患者單核細胞TYK2 mRNA表達(4.93±0.90)顯著升高(P<0.01)。

2.5TYK2 mRNA與患者SDAI評分的相關性分析 RA患者單核細胞TYK2 mRNA表達與SDAI評分呈顯著正相關(r=0.339 2，P<0.01)，見圖2。

表1 RA患者與健康志愿者血清骨代謝指標比較

圖1 RA患者與健康志愿者血清炎癥因子水平Fig.1 Levels of serum inflammatory factors between RA patients and healthy volunteers

圖2 RA患者TYK2 mRNA與SDAI評分相關性分析Fig.2 Correlation between TYK2 mRNA and SDAI score of RA patients

圖3 TYK2 mRNA與血清RF、抗CCP滴度的相關性分析Fig.3 Correlation between TYK2 mRNA and serum RF，anti-CCP

圖4 TYK2 mRNA與血清IL-2、IL-17和IL-21水平相關性分析Fig.4 Correlation between TYK2 mRNA and serum IL-2，IL-17，IL-21

圖5 TYK2 mRNA與血清OST、25(OH)D、β-CTX及T-P1NP水平相關性分析Fig.5 Correlation between TYK2 mRNA and serum OST，25(OH)D，β-CTX，T-P1NP

2.6TYK2 mRNA與RA標志物RF和抗CCP相關性分析 RA患者單核細胞TYK2 mRNA表達與其血清RF和抗CCP滴度均呈正相關(r=0.634 1、0.374 7，P<0.01或P<0.000 1)，見圖3。

2.7TYK2 mRNA與血清IL-2、IL-17和IL-21的相關性分析 RA患者單核細胞TYK2 mRNA表達與其血清IL-2、IL-17及IL-21水平均呈正相關(r=0.457 4、0.404 2、0.278 9，P<0.05)，見圖4。

2.8TYK2 mRNA與骨代謝指標相關性分析 RA患者單核細胞TYK2 mRNA表達與其血清OST、25(OH)D及T-P1NP水平呈負相關(r=-0.398 7、-0.430 4、-0.484 4，P<0.01)，與β-CTX呈正相關(r=0.324 3，P<0.05)，見圖5。

3 討論

酪氨酸激酶2(TYK2)是JAK激酶家族成員，該家族成員還包括JAK1、JAK2和JAK3，JAK激酶在調節細胞因子引起的炎癥方面起重要作用[10]。據報道，TYK2基因的多態性能夠不同程度地引起細胞炎癥因子應答，引發自身免疫系統紊亂，導致各種自身免疫性疾病[11,12]。本文對從50例健康志愿者和55例RA患者外周血分選的單核細胞進行了TYK2基因表達檢測，結果表明，與健康志愿者相比，RA患者外周血單核細胞TYK2 mRNA表達顯著升高。RA患者TYK2 mRNA表達與其SDAI評分呈正相關。

RF在RA患者體內出現最早，與RA存在顯著相關性，RF滴度越高，表明患者的病情越重，預后越差[13]。但RF的特異性不高，除在RA患者血清中表達外，在傳染病、肝功能障礙、惡性腫瘤及結締組織患者中也有表達[14]。近年研究發現，RA的病情進程與瓜氨酸相關抗體的產生與沉積聯系密切，其中以抗CCP最具代表性[15]。研究表明，抗CCP在早期RA診斷中具有較高的靈敏度和特異性。葛君琍等[16]檢測了117例RA患者血清中抗CCP滴度，結果發現其靈敏度為82.4%、特異性為93.5%。目前臨床常采用兩者聯合檢測法進行RA早期診斷。本研究檢測了55例RA患者血清中RF和抗CCP滴度，并將其與TYK2 mRNA表達進行了相關性分析，結果表明，TYK2基因表達與患者血清RF和抗CCP呈顯著正相關，提示TYK2基因與RA病理進程相關。

為進一步考察TYK2基因與RA的關系，本文檢測了RA相關炎癥因子IL-2、IL-17及IL-21水平。IL-2又稱T細胞生長因子，可誘導T細胞增生并促進免疫反應，引起局部慢性炎癥和基質破壞[17]。IL-17為T細胞源的促炎因子，主要由記憶型T細胞產生[18]。研究表明，在RA患者滑膜中發現高表達IL-17，IL-17的存在極大提高了滑膜細胞中MMP-1水平，導致滑膜細胞損傷[19]。此外，IL-17還可通過PI3K/AKT和NF-κB通路增強自身表達，并促進IL-6、IL-8和TNF-α分泌，加重患處炎癥程度[20]。IL-21是由CD4+T分泌的促炎細胞因子，與IL-21受體結合后通過自分泌的方式介導其本身的分泌，并上調Th1免疫反應的相關炎癥因子，研究證實，IL-21參與RA發病過程，并與病情進展高度相關[21]。本研究發現，RA患者血清中IL-2、IL-17和IL-21水平較健康志愿者顯著升高。TYK2作為JAKs激酶家族的重要成員，參與多種炎癥因子表達，TYK2 mRNA與此3種細胞因子均呈顯著正相關，表明TYK2參與RA的發生發展。

RA患者常出現慢性、反復炎癥反應，導致關節軟骨細胞退化甚至骨壞死，同時出現繼發性骨質疏松等骨代謝相關癥狀[4]。本研究檢測了RA患者血清骨代謝指標水平，發現RA患者血清OST、25(OH)D、T-P1NP水平均顯著下降，β-CTX水平顯著升高。相關性分析表明TYK2基因與OST、25(OH)D、T-P1NP呈顯著負相關，與β-CTX呈顯著正相關。

綜上所述，本研究初步分析了TYK2基因在RA患者中的表達，同時檢測了血清RA標志物、炎癥因子及骨代謝指標水平，并進一步分析了TYK2基因表達與檢測指標的相關性。結果表明，TYK2基因的表達與RA病情進展密切相關，其可能通過調控與其相關的IL-2、IL-17和IL-21水平參與疾病發展。針對TYK2基因的靶向治療可阻斷早期炎癥損傷，對于RA的預測、治療和預后具有重要價值。