棗種質果實黃酮含量及其抗氧化活性分析

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（1.山西農業大學 a.果樹研究所；b.果樹種質創制和利用山西省重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801）

棗Ziziphus jujubaMill.為鼠李科Rhamnaceae棗屬ZiziphusMill.植物，原產于我國，我國棗栽培的歷史悠久，棗品種資源豐富。棗是我國的主要經濟林樹種之一，也是我國的第一大干果樹種[1-2]。棗果實富含多糖、環核苷酸（cAMP 和cGMP）、黃酮、三萜酸、皂苷等生物活性成分[3-4]，是名貴的天然保健食品和重要的藥用材料，被國家衛生部列為“藥食同源”食品[5]。黃酮類物質是棗果中重要的功能性營養成分之一[6]，近年來因其具有天然生物活性而受到人們的廣泛關注。已有研究結果表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、鎮靜催眠、降血脂、降血壓、護肝保肝等生理功能[7-9]。因此，研究棗種質果實中黃酮的含量及抗氧化活性對于棗種質的鑒定評價和資源利用均有重要意義。

目前，有關棗種質中黃酮類物質的研究主要集中在提取工藝優化和栽培品種含量分析等方面。張瓊等[10]比較分析了以溶劑超聲浸提法、微波法和簡化QuEChERS 法提取棗果黃酮的效率，并對提取工藝的各參數進行了優化，結果發現，采用簡化QuEChERS 法可在30 min 內有效提取棗果黃酮。周曉鳳等[11]采用紫外分光光度法測定了10 個棗品種果實中總黃酮的含量，結果表明，各品種的平均含量為3.07 mg·g-1。然而，前人針對棗果實中黃酮的抗氧化能力的研究報道較少。袁亞娜等[12]研究了冬棗黃酮粗提物及其純化物對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH 自由基的清除能力，結果發現，冬棗黃酮類物質具有很好的抗氧化效果，并存在劑量效應關系。Gao 等[13]采用DPPH、ABTS 自由基清除能力及總還原力等評價方法測定了10 個栽培棗品種果實的抗氧化能力，結果表明，棗果實均表現出較高的Trolox（抗氧化劑）當量抗氧化能力，供試的10 個品種中，‘佳縣木棗’的抗氧化能力最強。但是，關于酸棗資源、觀賞資源、栽培品種等不同類型棗種質果實中黃酮及其抗氧化活性的系統研究尚未見諸報道。弄清不同類型種質資源棗果中的黃酮含量，是其資源合理開發與利用的前提。為此，從國家棗種質資源圃中選擇了50 份具有代表性的棗種質，對其果實中的黃酮含量及分別以FRAP 法、DPPH 法、ABTS 法等評價方法測得的抗氧化活性進行了比較分析，還研究了黃酮含量與抗氧化活性間的相關性，以篩選出黃酮含量高且抗氧化活性強的優特異棗種質，從而為棗黃酮代謝機理的研究和黃酮功能產品研發時的原料選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016—2018年在山西省農業科學院果樹研究所果樹種質創制和利用山西省重點實驗室進行，從國家棗種質資源圃中選取50 份具有代表性的棗種質脆熟期的果實（棗果半紅至多半紅）為試材。采樣樹為13年生的結果樹，其種植密度為2.5 m×3.0 m，其栽培條件和管理水平均一致。在果實脆熟期，將采集的樣品依次用自來水、蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，切成薄片，置于65 ℃的恒溫干燥箱中烘至恒重后粉碎，過80 目篩，然后置于-20 ℃的冰箱中保存以備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮提取液的制備

精密稱取待測樣品各3 份，每份2.000 g，將60%的乙醇20 mL 加入至50 mL 的離心管中，超聲提取60 min，以4 000 r·min-1的轉速離心5 min，然后將上清液轉移到50 mL的容量瓶中，重復提取2次，合并上清液，再以60%的乙醇定容至刻度，即可得到測定黃酮含量和抗氧化活性所用的提取液。

1.2.2 黃酮含量的測定

黃酮含量的測定，采用NaNO2-AI(NO3)3-NaOH比色法，參照Zhao 等[14]的方法（略有改動）進行操作。以蘆丁為標準物質繪制標準曲線。

1.2.3 抗氧化活性的測定

采用FRAP 法[15]測定提取物的總還原力，其抗氧化活性以AAE 當量（g·kg-1）表示。

參考Yemis 等[16]和Brand-Williams 等[17]的方法（有所改進），采用黃酮提取液對DPPH 自由基的清除能力評價其抗氧化活性。操作步驟如下：精密稱取DPPH 0.039 4 g，用無水乙醇溶解后定容于500 mL 的棕色容量瓶中（每天所用的DPPH溶液都是現用現配的），于4 ℃黑暗條件下保存以備用。將配好的DPPH 溶液1 mL 加入到盛有2 mL 稀釋后的黃酮提取液的試管中，立即搖勻，于室溫黑暗條件下培養30 min，然后用分光光度計測定517 nm 處的吸光度，記為Ac(t)；再以60%的乙醇代替黃酮提取液，測定517 nm 處的吸光度，記為Ac(0)。以Trolox 為標準物質設置不同濃度梯度，以濃度為橫坐標，以吸光度的變化值（Ac(0)-Ac(t)）為縱坐標，建立的回歸方程為：Y=0.464 6X-0.090 7，R2=0.993 1。提取液的抗氧化活性，用TE（Trolox當量）表示，其計量單位為mmol·g-1。

參考Nenadis 等[18]和于洋[19]的方法（有所改動），采用黃酮提取液對ABTS+·自由基的清除能力評價其抗氧化活性。操作步驟如下：精密稱取ABTS 40.00 mg，將其溶解于10 mL 的蒸餾水中，加入1.0 mg·mL-1的過硫酸鉀8.00 mL，于室溫避光條件下靜置16 h，轉移到250 mL 的容量瓶中，再加入32 mL 的蒸餾水，用無水乙醇定容至刻度，放置10 h 以備用。將配置好的ABTS 溶液稀釋，在734 nm 處測定到的吸光值約為0.7。將2 mL 稀釋后的ABTS 溶液加入到盛有2 mL 稀釋后的黃酮提取液的試管中，靜置30 min，并測定734 nm 處的吸光度，記為Ai；以60%的乙醇代替黃酮提取液，測定734 nm 處的的吸光度，記為A0。以Trolox為標準物質設置不同濃度梯度，以濃度為橫坐標，以吸光度的變化值（A0-Ai）為縱坐標，建立的回歸方程為：Y=0.694 7X+0.003 6，R2=0.997 6。提取液的抗氧化活性，用TE（Trolox 當量）表示，其計量單位為mmol·g-1。

1.3 數據分析

采用Microsoft excel 2003 和SPSS 18.0 軟件進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 棗種質果實黃酮含量分析

供試的50 份棗種質脆熟期果實中黃酮含量的分析結果見表1。由表1可知，不同棗種質間果實中的黃酮含量具有豐富的多樣性。50 份棗種質脆熟期果實中的黃酮含量為1.46 ～22.50 mg·g-1，其平均值為5.78 mg·g-1，其變幅為22.04，其變異系數為68.26%。其中，黃酮含量最高的種質為北京老虎眼，其含量高達22.50 mg·g-1；含量最低的種質是羊奶棗，其含量為1.46 mg·g-1；前者是后者的14.41 倍。高于平均含量的種質有17 份，低于平均含量的種質有33 份。

表1 50份棗種質脆熟期果實中的總黃酮含量Table1 Total flavonoid contentsin50 Chinesejujubecrisp ripening fruits mg·g-1

Shapiro-Wilk 正態性檢驗結果表明，50 份棗種質脆熟期果實中黃酮含量的分布規律表現為正態分布規律（P=0.053 ＞0.05）。50 份棗種質脆熟期果實中的黃酮含量分布頻率的分析結果如圖1所示。由圖1可知，50 份棗種質果實中，大部分種質棗果中黃酮含量的分布范圍為3.33 ～5.00 mg·g-1，此類種質有16 份，占供試種質總數的32.00%；其次是黃酮含量分布范圍分別為5.00 ～6.67、1.67 ～3.33、6.67 ～8.33 mg·g-1的種質，其種質份數分別有12、9、6 份，分別占供試種質總數的24.00%、18.00%、12.00%；而其他含量分布范圍的種質較少，如黃酮含量分別為10.00 ～11.67 與15.00 ～16.67 mg·g-1的種質 份 數分別有3 和2 份，分別占供試種質總數的6.00%和4.00%；黃酮含量最低（小于1.67 mg·g-1）和最高（大于20.00 mg·g-1）的種質各有1 份。

圖1 50 份棗種質果實中黃酮含量的分布情況Fig.1 Distribution of flavonoid contents in jujube germplasm fruits

2.2 抗氧化能力分析

分別采用FRAP法、DPPH 法、ABTS 法這3 種評價方法測定了不同棗種質果實黃酮提取液的抗氧化能力，結果見表2。表2表明，不同棗種質果實黃酮提取液均有不同程度的抗氧化活性。以FRAP 評價法測得的50 份棗種質果實黃酮提取液的抗氧化能力為2.83 ～18.44 g·kg-1，其均值為6.39 g·kg-1，其變幅為15.61，變異系數為44.77%。以DPPH 自由基清除能力評價法測得的50 份棗種質果實黃酮提取液的抗氧化能力為1.02 ～2.82 mmol·g-1，其 均 值 為1.70 mmol·g-1，其變幅為1.80，變異系數為23.53%。以ABTS 自由基清除能力評價法測得的50 份棗種質果實黃酮提取液的抗氧化能力為3.42 ～5.98 mmol·g-1，其均值為4.38 mmol·g-1，其變幅為2.56，變異系數為14.02%。采用3 種抗氧化活性評價方法測定的結果均表明，果實黃酮提取液抗氧化活性較強的棗種質分別為北京老虎眼、溆浦圓酸棗、獻縣酸棗、北京雞蛋棗、算盤棗、義烏棉絮棗等。

2.3 相關性分析

對50 份棗種質果實中的黃酮含量與分別以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法這3 種抗氧化能力評價方法測得的黃酮提取液的抗氧化能力間的相關性進行了分析，結果見表3。表3表明，分別以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法這3 種抗氧化能力評價方法測得的黃酮提取液的抗氧化能力與棗果實中的黃酮含量間均呈極顯著正相關，其相關系數分別為0.916、0.827、0.659。分別以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法評價得出的棗種質果實黃酮提取液的抗氧化能力間也呈極顯著正相關，其中，FRAP 和DPPH、FRAP 和ABTS、DPPH 和ABTS間的相關系數分別為0.799、0.753、0.573。

2.4 聚類分析

以50 份棗種質脆熟期果實中的黃酮含量為依據，采用系統聚類（Hierarchical clustering）中的Ward 法，以Euclidean 距離為遺傳距離進行聚類分析，結果如圖2所示。在遺傳距離為10.0 處可將供試棗種質分為3 大類。第1 類包含北京老虎眼、溆浦圓酸棗、獻縣酸棗、算盤棗、北京雞蛋棗、北京酸棗等6 份種質，其黃酮含量≥10.00 mg·g-1，此類種質數占供試種質總數的12.00%，可將此類種質定義為高黃酮含量類群，該類群主要為一些酸棗資源。第2 類包含義烏棉絮棗、大柿餅棗、早紅蜜、黃驊冬棗、臨猗梨棗等種質，此類種質共有18 份，5.00 mg·g-1≤黃酮含量＜10.00 mg·g-1，此類種質數占供試種質總數的36.00%，可將此類種質定義為中等黃酮含量類群。其余26 份種質都聚到第3類中，包括樂陵小棗、郎家園棗、保德油棗、棗強婆棗、夏津大白鈴等種質，此類種質數占供試種質總數的52.00%，其黃酮含量＜5 mg·g-1，可將此類種質定義為低黃酮含量類群。這一聚類分析結果可為今后有關棗種質果實中黃酮類物質的研究與利用提供參考依據。

表2 50 份棗種質果實黃酮提取液的抗氧化能力Table2 Antioxidant capacity of fruits in 50 Chinese jujube germplasms

表3 棗種質資源果實中黃酮含量與抗氧化能力的相關性?Table3 Correlation of flavonoid content and antioxidant capacity in Chinese jujube fruits

3 結論與討論

黃酮類物質是棗果實中的重要功能性營養成分之一，前人相關研究的供試品種主要是栽培品種，鮮有選用酸棗類、觀賞棗等不同類型種質來系統評價棗果實中黃酮的含量及抗氧化活性的研究報道。趙愛玲等[14,20]測定了50 個棗品種果皮中的黃酮含量，結果得出，棗果皮的黃酮含量高于棗果肉的黃酮含量。成熟果實是棗樹的主要利用部位[21]，本試驗研究了50 份具有代表性的棗種質脆熟期果實中的黃酮含量，結果發現，棗種質果實中黃酮含量的分布范圍較為廣泛，不同種質間其含量差異明顯，這與姜帆等[22]對枇杷花中黃酮含量的研究結果一致。以50 份棗種質脆熟期果實中的黃酮含量為依據進行了聚類分析，結果表明，果實中黃酮含量高的種質大多為酸棗資源，黃酮含量中等和較低的種質大多為栽培品種。因此，開發黃酮功能產品時，應選擇含量較高的種質果實為原料。棗和酸棗是棗屬植物中最重要的兩個種，棗較酸棗進化[23]，酸棗資源果實中黃酮含量高的原因可能是，其在進化為棗的過程中次生代謝物的代謝途徑發生了變化。前人研究結果表明，黃酮類物質含量與抗逆性有關[24]。酸棗長期處于野生狀態中，其抗逆性較棗更強，這可能與其黃酮含量較高密切相關。黃酮含量受多種因素的影響[25]，是由遺傳因素和環境條件共同決定的。關于棗種質黃酮類物質的代謝機理尚需從分子水平上進行深入研究。

圖2 50 份棗種質果實黃酮含量的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of flavonoid contents of 50 jujube fruits

已有研究結果表明，黃酮類物質具有抗氧化活性，能有效清除自由基[26]。棗果的“藥食同源”保健功能越來越受到人們的重視，這與其抗氧化活性等天然生物活性密不可分。本研究采用目前最常用的FRAP 法、DPPH 法、ABTS 法等3 種評價抗氧化能力的方法，分析了50 份具有代表性的棗種質脆熟期果實黃酮提取液的抗氧化活性，結果表明，棗種質果實黃酮提取液均有一定的抗氧化活性，其果實黃酮含量與以此3 種評價方法測定的抗氧化能力間均呈極顯著正相關，說明這3 種方法在評價抗氧化能力方面具有協同性與相似性，也進一步驗證了結果的可靠性，這與其他果樹（如李[27]、核桃[28]等）的研究結果一致。據此可根據黃酮含量的高低初步判定種質抗氧化活性的強弱。

本研究初步建立了棗種質黃酮含量的分級標準（高含量、中等含量、低含量），篩選出黃酮含量高且抗氧化活性強的棗種質12 份，其分別為酸棗種質4 份（北京老虎眼、溆浦圓酸棗、獻縣酸棗、北京酸棗）、觀賞種質2 份（算盤棗、大柿餅棗）和栽培棗種質6 份（北京雞蛋棗、義烏棉絮棗、早紅蜜、黃驊冬棗、臨猗梨棗和新疆小圓棗）。棗果中黃酮類物質的組分有多種，不同組分發揮著不同的生理功能，測定總黃酮含量及抗氧化活性，可初步了解不同種質棗果中黃酮含量的分布情況。今后可進一步采用液相色譜、氣質聯用、液質聯用等技術[29]鑒定棗果中黃酮類物質的組分，深入研究各組分的主要生理功能，并采用轉錄組、代謝組學等分子生物學手段研究其代謝途徑和調控機理，從而為高黃酮含量棗種質的創制和黃酮功能產品開發時原料的選擇及種質資源的綜合開發與利用提供理論參考依據。