外源激素處理對花椒插穗生根及其生理生化特性的影響

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（1.黃河下游森林培育國家林業和草原局重點實驗室，山東 泰安 271018；2.山東農業大學 林學院，山東 泰安 271018；3.山東省陽信縣職業中專，山東 濱州 251800；4.濟南市林業科技推廣站，山東 濟南271100；5.上海市環境學校，上海 200135；6.山東省國土空間數據遙感技術中心，山東 濟南 250002）

扦插繁殖是植物無性繁殖中應用最廣泛的一種傳統技術，是用部分或全部營養器官作為繁殖材料，在適宜條件下插入土壤或營養基質中，促使其發生不定根或不定芽，利用植物細胞的全能性培育成完全獨立植株的一種無性繁殖方法[1-2]。

影響插穗扦插成活的因素較多，如植物品種、溫度、插穗成熟度、插床類型、基質以及外源激素等[3]，其中，外源激素處理對花椒Zanthoxylum bungeanum扦插生根有顯著影響[4]。1935年，Zimmerman 等[5]發現α-NAA 和IAA 等8 種 新的有機化合物能促進根系生長，諸多學者便開始研究生長素對花椒扦插育苗的作用。陳榮江等[6]開展了生長素種類和濃度的正交設計試驗，發現在一定濃度范圍內，IAA（indole-3-acetic acid）和NAA（indoleethyl butyric acid）配合使用可明顯提高花椒插穗的生根率；宋建偉等[7]用不同質量濃度IBA 處理花椒硬枝插穗，發現50 ～100 mg/L IBA（indoleethyl butyric acid）處理12 h 效果較好，且明顯縮短了育苗時間。另外，在扦插基質方面，王麗敏[8]經研究發現，適宜的溫度和濕度條件下，進行小花花椒扦插時選用有機基質比無機基質成活率高，生根時間縮短，原因是有機基質多由珍珠巖、蛭石以及草炭等材料組成，具有養分含量高、透水性強、透氣性好等特點。

隨著花椒產品資源的開發和利用，以及人們對飲食要求的提高，花椒作為調味食品越來越受到青睞，其市場潛力巨大。若要增加花椒的生產效益，提高花椒的經濟價值，首先應提高花椒的苗木質量，并保持其優良的生產特性。本試驗中以‘獅子頭’嫩枝為試材，使用不同濃度不同種類的外源激素處理其插穗后進行扦插試驗，測定扦插生根關鍵物質和生物酶活性，并持續觀測根系發育過程，旨在探索激素促進花椒根系發生和發育的生理機制，為花椒優良品種的繁育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

在山東省泰安市夏張鎮優木苗圃合作社溫室內進行扦插試驗。溫室長20.0 m，寬4.0 m，高2.5 m，溫室內采用全日照間歇式噴霧裝置和水簾降溫系統控制溫濕度。扦插前10 d，噴施0.3%KMnO4溶液對基質進行消毒處理，同時將基質深翻、攪勻后，用地膜覆蓋2 d，揭開，攤晾通風后備用。采用50穴育苗穴盤（54 cm×28 cm）進行扦插，穴盤底部鋪設碎石子和河沙，防止水分積聚。

1.2 試驗設計

2019年6月，以生長一致的2 ～3年生‘獅子頭’實生苗嫩枝為試材進行扦插。將插穗在0.1%KMnO4溶液中浸泡消毒1 h 并洗凈后，在不同質量濃度、不同種類的外源激素中浸泡插穗1 h，分別為250、500 mg/L 的IAA（處理編號T2、T3）、IBA（處理編號T4、T5）和NAA（處理編號T6、T7），然后剪掉插穗基部1 cm，將其洗凈用于扦插，以清水處理為對照（處理編號T1）。選用珍珠巖和蛭石的混合基質（質量比為2∶1）作為扦插基質，采用直插法進行扦插。采用完全隨機區組試驗設計，每小區扦插150 株，重復3 次。

1.3 管理方法

扦插后，各處理穴盤做好標記，且各扦插處理幼苗均采取統一田間管理措施。溫室內環境溫度為24 ～28 ℃，相對濕度約為70%。生根前，每隔5～7 d分別用0.5%多菌靈溶液和0.3%KMnO4溶液進行交替消毒，防止細菌、病蟲導致的扦插苗基部感染或腐爛。生根后至移栽前，進行消毒滅菌處理，給予幼苗良好的生長環境。

1.4 測定方法

扦插后，每隔10 d 采樣1 次，觀察插穗基部變化情況。每個處理取10 株健康植株，剝取基部3 cm 的韌皮層，用蒸餾水洗凈后，在液氮中儲存，帶回實驗室于-80 ℃保存待測。超氧物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍四唑法（nitroblue tetrazolium，NBT）測定[9]，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創木酚法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法于630 nm 波長下測定，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性采用鄰苯二酚比色法[10]測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250 法于595 nm 波長下測定，吲哚乙酸氧化酶（indoleacetic acid oxidase，IAAO）活性采用紫外分光光度法于530 nm波長下測定[11]。各指標重復測定3 次，并記錄數據。60 d 后，調查統計不同處理的插穗生根成活情況，包括生根數量、根長、生根率、平均根長、根數和生根指數，并記錄數據。

1.5 數據分析

使用Excel 2013 軟件對數據進行統計分析，使用SPSS 22.0 軟件對所有指標進行方差分析和Duncan 多重比較。為避免使用單一指標評價插穗生根效果的片面性，通過計算生根效果指數對其進行評價分析。

生根效果指數=(成活率/插穗成活數)×平均根長×生根數。

2 結果與分析

2.1 花椒插穗根系發生進程

扦插后，取樣觀察插穗生根進展，結果如圖1所示。扦插后10 d 時，插穗基部皮孔膨脹、外凸、開裂（圖1A），并在韌皮部與木質部夾層形成乳白色幼嫩組織，即愈傷組織（圖1B）；扦插后15 ～20 d，愈傷組織繼續膨大，有愈傷組織形成的插穗數量繼續增加（圖1C）；扦插后25 ～30 d，愈傷組織已不再生長，部分插穗愈傷組織開始褐變；地上部分出現萌芽，幼葉也開始發育，不定根從愈傷組織處（圖1D）或皮孔開裂處（圖1E）發生后進行伸長生長，且數量逐漸增多（圖1F），同時，插穗地上部分形成幼嫩新梢（圖1G）。

成活的插穗中，愈傷組織和皮部均能生根，其中，愈傷組織生根株數占生根總數的73.25%，皮部生根株數占生根總數的25.62%，兩者均生根的比例為1.13%。由此可見，多數花椒扦插苗不定根的發生屬愈傷組織生根型，即插穗基部下切口以上3 cm 范圍出現明顯膨大且長出根系（圖1F）。另外，若干皮部生根插穗的基部水分吸收過多，腐爛較為嚴重，甚至死亡（見圖1H）。少部分插穗組織腐爛卻正常生根（圖1I）。花椒扦插生根過程大致分為4 個階段：扦插后0 ～10 d為花椒愈傷組織誘導期；扦插后10 ～30 d 為不定根形成期；扦插后30 ～40 d 為不定根伸長期；扦插40 d 以后為生根后期。

2.2 激素處理對花椒插穗生根指標的影響

不同濃度激素處理中花椒插穗的生根情況存在差異（表1）。不同濃度激素處理后，花椒插穗的生根率、生根數量、平均根長和生根效果指數等方面均具有顯著差異（F=23.35，P＜0.05）。按照IAA 處理后花椒成活率由高到低排序，各處理依次為T2、T3、T1，根系形態特性與之表現相同。在IBA 處理中，以250 mg/L IBA 處理效果最好，T4 和T5 處理的插穗成活率較T1 處理分別提高了119.53%、82.59%，T4 處理的插穗生根數量、平均根長和生根效果指數較T1 處理分別提高76.58%、46.79%和159.70%。在NAA 處理中，按照插穗生根數量、平均根長和生根效果指數由高到低，各處理依次均為T7、T6、T1，說明在一定濃度范圍內，較高濃度的NAA 更有利于根系的發生。

2.3 激素處理對花椒插穗生理生化指標的影響

2.3.1 可溶性蛋白含量變化

不同激素處理中花椒插穗可溶性蛋白含量的變化不同（圖2）。T1 和T2 處理中，插穗可溶性蛋白含量隨扦插時間的延長而逐漸降低，其他處理中其含量大致表現為“降低—升高—降低”的變化趨勢。扦插后0 ～20 d 時，插穗可溶性蛋白含量緩慢下降，其中，T4 和T7 處理中插穗可溶性蛋白含量下降速度較快，由最初的25.17 mg/g分別下降至20.08、21.34 mg/g，二者平均下降比例為19.71%。扦插后20 ～40 d 為不定根形成和伸長階段，該時期插穗可溶性蛋白含量逐漸升高。另外，T3、T4 和T6 處理中插穗可溶性蛋白含量在扦插后40 d 時達到峰值，T5 和T7 處理中其含量在扦插后30 d 時達到峰值。而T1 和T2 處理中插穗可溶性蛋白含量持續下降，扦插后20 ～50 d時，T1 處理中其含量由22.35 mg/g 急劇下降至13.25 mg/g；T2 處理中其含量下降趨勢相對平緩，由22.07 mg/g 降至18.89 mg/g。

圖1 花椒扦插生根過程中不同階段插穗的情況Fig.1 Rooting development properties of Z.bungeanum in different cutting stages

表1 不同濃度激素處理中花椒插穗的生根情況Table1 Duncan multiple comparisons of rooting parameters with various exogenous hormones treatments in pepper cuttings

2.3.2 可溶性糖含量的變化

不同激素處理中花椒插穗可溶性糖含量的變化大致相似（圖3），均呈現“下降—上升—下降”的變化趨勢。扦插后0 ～10 d 時，可溶性糖含量持續下降。扦插后10 ～30 d 時，不定根開始形成，插穗萌芽抽枝并展葉，可溶性糖含量提高。其中，T1、T5 和T7 處理中可溶性糖含量在扦插后40 d時達到峰值，其余處理在扦插后30 d 時達到峰值。與之不同的是，清水處理后不同時期中插穗可溶性糖含量均低于各激素處理，且有顯著差異。另外，在愈傷組織誘導期，清水處理中插穗可溶性糖含量的下降速度明顯高于各激素處理（P＜0.05）。扦插后30 ～50 d，不同處理的插穗不定根迅速伸長，可溶性糖含量持續下降。

圖2 不同激素處理中花椒插穗可溶性蛋白含量的變化Fig.2 Changes of soluble protein contents during rooting process of pepper cuttings

圖3 不同激素處理中花椒插穗可溶性糖含量的變化Fig.3 Changes of soluble sugar contents during rooting process of pepper cuttings

2.3.3 SOD 活性的變化

不同激素處理中花椒插穗SOD 活性隨著生根進程均呈先升高、后降低的變化趨勢（圖4），且除T5 處理中SOD 酶活性在扦插后10 d 時低于T1處理外，其他激素處理在不同測定時間的SOD 酶活性均高于對照（T1）。扦插后30 d 時，與T1相比，其他處理中插穗SOD 活性均提高，分別提高了36.47%、20.57%、38.35%、11.09%、51.50%和8.53%；而T1 處理在扦插后40 d 時SOD 酶活性到達峰值，之后便開始逐漸下降。另外，對照組和激素處理組插穗SOD 活性峰值出現的時間均為不定根表達時期，而激素處理中SOD 活性峰值出現的時間早于T1 處理。

2.3.4 POD 活性的變化

不同激素處理中花椒插穗POD 活性在不同生根時期內變化趨勢基本一致（圖5），均表現為“升高—降低—升高—降低”的變化趨勢，且不同處理之間差異顯著（P＜0.05）。扦插后0 ～10 d 時，為扦插前期，即愈傷組織誘導時期，POD 活性迅速上升，且大致在扦插后10 d 時達到峰值。之后POD 活性在扦插后20 d 時降低，且T1 處理中其活性均低于其他激素處理。隨后在不定根表達時期又出現1 個明顯的峰值，且此時POD 活性較第1 峰值顯著提高（P＜0.05），其中，T1、T2、T5 和T7 處理在扦插后30 d 時出現第2 峰值，而T3 與T6 處理峰值出現時間滯后于上述4 個處理，其第2 峰值在扦插后40 d 時出現。在生根伸長期，不同處理中插穗POD 活性均下降。

圖4 不同激素處理中花椒插穗SOD 活性的變化Fig.4 Changes of superoxide dismutase (SOD) activity during rooting process of pepper cuttings

圖5 不同激素處理中花椒插穗POD 活性的變化Fig.5 Changes of peroxidase (POD) activity during rooting process of pepper cuttings

2.3.5 PPO 活性的變化

不同激素處理中花椒插穗PPO 活性的變化不同（圖6）。T1（CK）處理中插穗PPO 活性表現為先下降、后上升、再下降的變化趨勢，各激素處理組中PPO 活性均呈緩慢上升后下降的變化趨勢。扦插后10 d 時，即愈傷組織誘導期，此時T1處理中PPO 活性緩慢下降，但差異不顯著，激素處理則提高了PPO 活性，其活性為逐漸上升的變化趨勢。扦插后20 d 時，不定根開始形成，T1 處理中PPO 活性降低，而激素處理同樣促進了PPO活性的提高。生根后期，不同處理中PPO 活性均顯著下降。另外，T1 處理中插穗PPO 活性在扦插后30 d 時達到峰值；激素處理組表現不同，其在扦插后20 d 時即達到峰值，較T1 處理提前10 d。

圖6 不同激素處理中花椒插穗PPO 活性的變化Fig.6 Changes of polyphenoloxidase (PPO) activity during rooting process of pepper cuttings

2.3.6 IAAO 活性的變化

不同激素處理中花椒插穗IAAO 活性變化趨勢基本一致（圖7），大致表現為生根前期至中期時其活性有所升高，至生根后期呈現緩慢降低的變化趨勢。扦插后0 ～10 d 時，即愈傷組織誘導期，IAAO 活性提高。扦插后10 ～20 d 時，即不定根形成期，T1 處理IAAO 活性略有升高，各激素處理中其活性均劇烈下降。扦插后20 ～30 d 時，為不定根形成后期，各激素處理中IAAO 活性表現為上升的變化趨勢，而T1 處理表現相反。扦插后30 ～40 d 時，不定根開始伸長生長，IAAO 活性隨之逐漸下降。進入生根后期時，各處理中IAAO活性變化趨于平緩，且不同激素處理間存在一定的差異，這與PPO 和POD 活性變化規律相似。

3 結論與討論

本研究結果表明：‘獅子頭’花椒扦插生根類型以愈傷組織生根型為主，少數為皮部生根類型；在不同的激素種類和質量濃度中，250 mg/L IBA處理花椒插穗后生根效果最好。扦插后，花椒不定根的形成大致分為4 個階段：扦插后0 ～10 d為花椒愈傷組織誘導期；扦插后10 ～30 d 為不定根形成期；扦插后30 ～40 d 為不定根伸長期；扦插40 d 以后為生根后期。適宜濃度的外源激素可促進生根關鍵酶活性的提高，促進花椒不定根的發生，且不定根發生與插穗可溶性蛋白含量關系密切。外源IAA 和IBA 處理中，隨著激素濃度的增加，插穗成活率先升高、后降低，且在激素質量濃度為250 mg/L 時到達峰值；外源NAA 處理中，500 mg/L 處理的插穗生根效果最好。花椒插穗生根過程中，可溶性蛋白和可溶糖含量表現為先降低、后升高、再降低的單峰型變化規律。在愈傷組織誘導期，呼吸作用增強，代謝旺盛，二者含量迅速下降；在不定根伸長期，隨著葉片光合作用增強，光合產物不斷積累，二者含量到達最高點；隨著幼苗生長消耗，其含量逐漸下降。外源激素的種類及其濃度對花椒扦插生根相關酶活性的提高有顯著影響。SOD 活性提高利于不定根的形成；PPO 與IAAO 變化趨勢相似，二者均與愈傷組織的形成關系密切；POD 同樣對根原基的誘導和不定根的發生起重要作用。

圖7 不同激素處理中花椒插穗IAAO 活性的變化Fig.7 Changes of indoleacetic acid oxidase (IAAO) activity during rooting process of pepper cuttings

植物激素具有促進植物細胞分裂和伸長的作用，可以促進插穗不定根的伸長生長，植物生長激素的種類及其濃度與植物生根有密切關系[12]。Yan 等[13]用1 500 mg/L IBA 處理繡球丁香Syringa microphylla后，插穗成活率顯著提高；郭其強等[14]經研究發現使用100 mg/L ABT 溶液浸泡插穗3 h，對藏柏Cupressus torulosa和巨柏C.gigantea愈傷組織產生和根系發育有促進作用；外源激素不僅可以提高插穗的成活率，還可以加快根原基的誘導，促進不定根的發生[15]。不同種類的外源激素對植物的作用效果有所差異，且其濃度的不同對不定根發生與生長的作用也有差異。因此，在實際生產中，應嚴格選擇植物外源激素的種類，并控制激素的濃度和處理時間，做到因植物種類而異，因植物的生物學特性而異。在本試驗條件下，從綜合成活率和生根效果指數來看，選取250 mg/LIBA 浸泡處理‘獅子頭’花椒插穗2 h 最為適宜。在相關研究報道中，在速蘸條件下，IAA 與NAA配合使用，‘大紅袍’插穗生根效果更佳[6]；在50 ～100 mg/L 的IBA 中浸泡12 h，插穗的生根率較高[5-6]；600 mg/L GGR 處理日本朝倉花椒插穗，可提高其扦插成活率[16]。因此，各種生長素混合使用，可以提高插穗的成活率，縮短育苗時間和幼苗生根發育進程，促進根系發育。本試驗中激素種類和處理時間單一，應對混合激素的種類、濃度和處理時間在花椒扦插繁育中的應用進一步研究。

在插穗愈傷組織發生和不定根生長過程中，營養物質被大量消耗，供應細胞分裂與分化所需養分，維持插穗正常的生命代謝活動[17]。可溶性糖可作為呼吸底物直接被利用，在插穗切口處迅速積累，供給大量不定根形成所需的消耗，是插穗生根過程中的直接能量來源[18]。本研究結果表明，花椒插穗整個生根過程中可溶性糖含量均大于可溶性蛋白含量，與閩楠Phoebe bournei嫩枝扦插與楓楊Pterocarya stenoptera硬枝扦插的研究結論一致[19-20]。這是因為二者在氧化分解、釋放能量的同時，保留葉片和插穗新梢葉片可通過呼吸作用加速淀粉水解為可溶性糖，同時將過剩的可溶性糖儲存，使得其含量增加。在本研究中還發現，外源激素處理條件下，可溶性糖和可溶性蛋白2 類營養物質的含量在生根過程中呈現“下降—上升—下降”的變化規律，這與歐榛Corylus avellana和蒙椴Tilia mongolica的扦插試驗結果相似[21-22]。產生這種變化趨勢的主要原因是，在愈傷組織誘導期，呼吸作用增強，代謝旺盛，為防止切口感染，插穗進行自我保護而消耗能量，二者含量迅速下降；在不定根伸長期，隨著葉片抽梢生長，光合作用增強，光合產物不斷積累，二者含量到達峰值；在不定根形成后期，花椒幼苗進行正常生理活動，消耗糖和蛋白質等營養物質，使得二者含量降低。而清水處理中營養物質含量變化相對較小，峰值出現的時間存在滯后現象，可見，適宜濃度的外源激素處理對花椒不定根發生的促進作用與營養物質的合成和積累密切相關[23]。

生根相關生物酶活性對花椒扦插苗不定根的發生與生長具有直接或間接的作用[24-25]。本研究結果表明，SOD 和PPO 活性在生根進程中均呈現先升高、后降低的趨勢，外源激素的添加促進了花椒插穗生根前期誘導酶活性的升高，這與滇杠柳Periploca forrestii和青榨槭Acer davidii的扦插試驗結果一致[26-27]。在本研究中，SOD 活性峰值出現在不定根表達時期，PPO 活性峰值出現在不定根形成期，這表明SOD 活性提高有利于不定根的形成與分化，這與東京野茉莉Styrax tonkinensis扦插生根過程中SOD 活性的變化趨勢一致[28]。PPO 促進愈傷組織形成，在不定根伸長期，較低活性的PPO可以提高IAA 水平，從而促進不定根發育[29]。

POD 和IAAO 活性同樣可以作為評價愈傷組織形成能力和不定根生成能力的指標[30]。本研究結果表明，POD 和IAAO 活性在愈傷組織誘導期均呈上升趨勢，之后下降，在不定根形成期又明顯升高，于不定根表達期再次下降，二者均呈雙峰型變化，分別參與愈傷組織的誘導和不定根的表達，這與朝鮮薊Cynara scolymus和文冠果Xanthoceras sorrborifolia的扦插試驗結果一致[31-32]，但與王艷晶等[33]得出的研究結論不同。可見，POD 和IAAO 對插穗產生不定根的影響較為復雜，可能因樹種或處理方式的不同而產生不同的作用效果，應進一步研究POD 和IAAO 影響花椒扦插苗根系發生的作用機理。